本文選題：天然無(wú)內(nèi)含子mRNA + 轉(zhuǎn)運(yùn)出核　； 參考：《大連醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：背景:mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)出核一直是RNA領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)與難點(diǎn),近些年的研究中發(fā)現(xiàn)mRNA中存在調(diào)控其轉(zhuǎn)運(yùn)出核的順式作用元件[1]。在高等生物中,出核轉(zhuǎn)運(yùn)與剪接過程是關(guān)聯(lián)十分密切的。在mRNA發(fā)生剪接過程時(shí),剪接復(fù)合體會(huì)直接招募出核轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體并共同完成剪接與出核兩種生命活動(dòng)[2-5]。刪除基因的內(nèi)含子后,mRNA會(huì)因?yàn)榧艚邮录慕K止而被阻滯在細(xì)胞核內(nèi)[6]。所以在剪接與轉(zhuǎn)運(yùn)出核相偶聯(lián)的mRNA中,內(nèi)含子就成為轉(zhuǎn)運(yùn)出核的順式作用元件[7]。天然無(wú)內(nèi)含子mRNA占全部mRNA的5%,其中包含著像干擾素、組蛋白等對(duì)生物體的生命過程非常重要的基因[8]。天然無(wú)內(nèi)含子mRNA其本身因不具有內(nèi)含子而不會(huì)發(fā)生剪接過程,那么這些天然無(wú)內(nèi)含子的mRNA是否同樣存在轉(zhuǎn)運(yùn)出核的順式作用元件呢?本實(shí)驗(yàn)室在之前對(duì)4個(gè)天然無(wú)內(nèi)含子mRNA(HSPB3、IFNα1、IFNβ1,、c-Jun)的研究中,發(fā)現(xiàn)4條mRNA中的保守序列CAR-E(促細(xì)胞質(zhì)區(qū)域聚集元件)能夠促進(jìn)已阻滯在細(xì)胞核內(nèi)的β-球蛋白c DNA轉(zhuǎn)運(yùn)出核[9]。那么在更大范圍的天然無(wú)內(nèi)含子mRNA中是否同樣存在這樣功能的順式作用元件?這些順式作用元件的結(jié)合蛋白是什么?目前的研究依然沒有解決這些問題。本文通過對(duì)天然無(wú)內(nèi)含子mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)出核機(jī)制的研究完善mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)出核機(jī)制。方法:1.通過生物信息學(xué)比對(duì)軟件MEME對(duì)天然無(wú)內(nèi)含子的mRNA數(shù)據(jù)庫(kù)(Intronless Gene Database)進(jìn)行比對(duì),檢索其中存在的共有片段。2.將獲取的共有片段與已驗(yàn)證阻滯在細(xì)胞核內(nèi)的β-球蛋白的c DNA進(jìn)行重組連接,通過原位熒光雜交技術(shù)(FISH)尋找可以促進(jìn)c DNA發(fā)生出核轉(zhuǎn)運(yùn)的片段。3.通過生物信息學(xué)軟件FIMO對(duì)天然無(wú)內(nèi)含子mRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行反檢索,找到含有促進(jìn)c DNA出核序列的天然無(wú)內(nèi)含子mRNA,并對(duì)其中預(yù)測(cè)的順式作用元件進(jìn)行堿基刪除、突變,檢測(cè)其在天然無(wú)內(nèi)含子mRNA中是否具有促進(jìn)出核的功能。4.構(gòu)建預(yù)測(cè)元件、β-球蛋白c DNA與p CDNA5載體的重組質(zhì)粒。利用Flp-In系統(tǒng)在FRT-Hela細(xì)胞中構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。并通過MS2-MBP蛋白純化體系與質(zhì)譜分析方法確定順式作用元件的結(jié)合蛋白[10]。結(jié)果:通過生物信息學(xué)軟件MEME將679個(gè)天然無(wú)內(nèi)含子mRNA數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)其中含有多條共有序列。FISH實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在預(yù)測(cè)的順式作用元件中有4條能夠促進(jìn)β-球蛋白c DNA的mRNA出核轉(zhuǎn)運(yùn),我們分別命名為motif1-AS、motif 1V-AS、motif 4-AS、motif 5。天然無(wú)內(nèi)含子mRNA KRN1基因中含有9個(gè)預(yù)測(cè)元件motif1V-AS,其中6個(gè)元件位置相近我們將這6個(gè)元件整體命名為CAR-C。通過分子克隆的方法將CAR-C進(jìn)行刪除與突變,FISH實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示刪除與突變后的KRN1 mRNA會(huì)被阻滯在細(xì)胞核內(nèi)。完成穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞構(gòu)建后我們通過MS2-MBP蛋白結(jié)合體系,得到預(yù)測(cè)元件的結(jié)合蛋白,并通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)后的銀染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)促出核元件結(jié)合蛋白與非促出核元件結(jié)合蛋白存在特異性條帶。結(jié)論:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明預(yù)測(cè)中具有促進(jìn)β-球蛋白c DNA轉(zhuǎn)運(yùn)出核功能的元件在天然無(wú)內(nèi)含子mRNA中同樣起到促進(jìn)其轉(zhuǎn)運(yùn)出核的功能。
[Abstract]:Background: mRNA transshipment is always a hot and difficult problem in the field of RNA. In recent years, it is found that there is a cis acting element in mRNA that regulates its transshipment, [1]. is closely related to the process of transshipment and splicing in higher organisms. In the splicing process of mRNA, the splicing compound directly recruits nuclear transfer complex. After combining and co completing the introns of the two life activities [2-5]. deletion genes, mRNA will be blocked in the nucleus [6]. because of the termination of the splicing event, so the intron is the cis acting element of the transshipment nucleus, [7]. natural intron mRNA, which accounts for 5% of all mRNA, because of the termination of the splicing event. It contains the [8]. natural intron, such as interferon, histone, and so on, which is very important for the life process of the organism, mRNA itself because it does not have introns and does not have the splicing process. Then, do these natural introns mRNA also have a cis component that transshipped the nucleus? The laboratory was before the 4 natural In the study of the intron mRNA (HSPB3, IFN alpha 1, IFN beta 1, c-Jun), it was found that the conserved sequence CAR-E in 4 mRNA (cytoplasmic regional aggregation elements) could promote the nucleation of the beta globulin C DNA transshipment out of the nucleus in the nucleus, then whether there is a cis acting element in the larger natural intron mRNA. What are the binding proteins of these cis acting elements? The current research still does not solve these problems. This paper improves the mechanism of mRNA transshipment through the study of the mechanism of natural intron mRNA transshipment. Method: 1. the mRNA database (Intronless Gene Database) of natural intron, by bioinformatics comparison software MEME In comparison, the common fragment of the existing fragment.2. was retrieved to recombine the obtained common fragments with the C DNA that had been verified to be blocked in the nucleus. Through in situ fluorescence hybridization (FISH), a fragment of.3. that could promote the nuclear transport of C DNA was found through the bioinformatics software FIMO to the natural intron mRNA data. The library carries out reverse retrieval and finds the natural intron mRNA containing the promoter of the C DNA nucleation sequence, and deletes the bases for the cis acting elements predicted in it, and detects whether it has the function.4. construction prediction element in the natural intron mRNA, and the recombinant plasmid of the beta globulin C DNA and P CDNA5 carrier. Use Flp-In. The system constructs a stable cell line in FRT-Hela cells. Through the MS2-MBP protein purification system and mass spectrometry analysis, the binding protein [10]. results of cis acting elements are determined. By comparing the 679 natural intron mRNA data by the bioinformatics software MEME, it is found that the results of the.FISH experiment containing multiple common sequences are shown in the experimental data. 4 of the predicted cis elements can promote the mRNA nuclear transfer of beta globulin C DNA. We named motif1-AS, motif 1V-AS, motif 4-AS, motif 5. naturally without intron mRNA KRN1 gene containing 9 predictive elements motif1V-AS, of which 6 components are similar to the 6 components. CAR-C was deleted and mutated by the method of subcloning. The results of FISH experiment showed that the deletion and mutation of KRN1 mRNA would be blocked in the nucleus. After the completion of the cell construction, we obtained the binding protein of the predictive element through the MS2-MBP protein binding system, and the silver staining experiment after the polyacrylic acid gel electrophoresis (PAGE) was found to be promoted. There is a specific band between the binding protein of nuclear element binding protein and non stimulating nuclear element. Conclusion: the experimental data show that the element that can promote the function of nucleation of beta globulin C DNA transport in the natural intron mRNA also plays a role in promoting the transfer of nucleus in the natural intron mRNA.

【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q78

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本文編號(hào)：1868615