本文關(guān)鍵詞：化膿性鏈球菌溶血素O和人視黃醇結(jié)合蛋白的表達(dá)與純化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《南京師范大學(xué)》 2015年

化膿性鏈球菌溶血素O和人視黃醇結(jié)合蛋白的表達(dá)與純化

齊亞坤  

【摘要】：目前,表達(dá)外源基因時(shí)一般會(huì)首先選擇大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng),但是外源基因在大腸桿菌(Escherichia coli,E. coli)中高效表達(dá)時(shí)容易形成包涵體。本文選取兩種不同來(lái)源的基因,嘗試從不同的方面去解決它們?cè)谒拗骶懈咝П磉_(dá)時(shí)形成包涵體的問(wèn)題。化膿性鏈球菌溶血素O (Streptolysin O, SLO)是含-SH基的蛋白質(zhì),對(duì)紅細(xì)胞等多種細(xì)胞有損傷作用,有較強(qiáng)的抗原性,能引起咽炎、風(fēng)濕熱及急性腎小球腎炎等疾病。本文從化膿性鏈球菌中克隆編碼SLO的基因,去掉了N端70個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的堿基序列,在熱激表達(dá)載體pHsh中,重組蛋白SLO的表達(dá)量較低并且大部分在沉淀當(dāng)中,降低誘導(dǎo)溫度和設(shè)置不同的誘導(dǎo)時(shí)間后,表達(dá)量低和形成包涵體的問(wèn)題沒(méi)有明顯改善。在冷激表達(dá)載體pEXC中,重組蛋白SLO的表達(dá)量明顯提高,同時(shí)全部是可溶性表達(dá)。接著對(duì)重組蛋白SLO的表達(dá)進(jìn)行了一系列的表達(dá)優(yōu)化：首先是選取不同的表達(dá)宿主,在四種表達(dá)宿主Ecoli DH10B、Ecoli JM109。E.coli BL21、 E.coli TOP10中分別進(jìn)行表達(dá),SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)在Ecoli BL21中重組蛋白的表達(dá)量最高；其次是N端二級(jí)結(jié)構(gòu)優(yōu)化,軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)核糖體結(jié)合位點(diǎn)和翻譯起始位點(diǎn)均形成了發(fā)卡結(jié)構(gòu),通過(guò)基因定點(diǎn)誘變解開發(fā)卡結(jié)構(gòu),但是經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)重組蛋白的表達(dá)量并沒(méi)有明顯提高；最后是稀有密碼子的優(yōu)化,對(duì)編碼SLO的基因進(jìn)行軟件預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)對(duì)于宿主大腸桿菌,基因序列共有20處密碼子偏好性較低,選取兩處進(jìn)行同義突變,經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)重組蛋白的表達(dá)量并沒(méi)有明顯提高。經(jīng)Ni親和層析和DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析純化后,純化得到SLO的產(chǎn)量約18 mg(1 L的LB培養(yǎng)基中),Western Blot分析,發(fā)現(xiàn)純化的重組SLO蛋白與小鼠抗6×His抗體有很高的特異性反應(yīng),,同時(shí)對(duì)純化蛋白進(jìn)行溶血活性分析,發(fā)現(xiàn)SLO終濃度為80 ng/mL時(shí)能完全溶血。人視黃醇結(jié)合蛋白(Retinal binding protein, RBP)是一種疏水性的小分子結(jié)合蛋白,在檢測(cè)腎臟和肝臟相關(guān)方面的疾病有很重要的指示作用。本文主要通過(guò)構(gòu)建四種不同的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pHsh-rbp、pHsh-ex-rbp、pEXC-rbp、 pTrc99a-rbp和一種粟酒裂殖酵母表達(dá)質(zhì)粒peno-GFAT-cpy-rbp,在大腸桿菌中運(yùn)用了熱激、冷激、分泌型、IPTG四種不同的表達(dá)方式,并在各自表達(dá)條件下設(shè)置一系列的溫度、誘導(dǎo)時(shí)間及誘導(dǎo)起始OD梯度變化,但是這些方式對(duì)重組蛋白R(shí)BP的可溶性表達(dá)并沒(méi)有明顯的促進(jìn)作用。重組蛋白R(shí)BP在粟酒裂殖酵母中實(shí)現(xiàn)了可溶性的分泌型表達(dá),但是重組蛋白只在EMM培養(yǎng)基中表達(dá),在YES培養(yǎng)基中不表達(dá),對(duì)重組蛋白的表達(dá)進(jìn)行稀有密碼子優(yōu)化和誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)稀有密碼子優(yōu)化對(duì)重組蛋白的表達(dá)量沒(méi)有明顯的提高,而重組RBP在粟酒裂殖酵母生長(zhǎng)到穩(wěn)定期的中后期時(shí)候表達(dá)量較高。分別對(duì)大腸桿菌中冷激誘導(dǎo)表達(dá)的RBP和粟酒裂殖酵母中分泌表達(dá)的RBP進(jìn)行純化,最后在1L各自的培養(yǎng)基中得到了約8 mg和10 mg的重組蛋白R(shí)BP,分別用鼠抗6×His抗體進(jìn)行Western Blot分析,兩種方式得到的蛋白均能和抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q78
【目錄】：

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