本文關(guān)鍵詞：化膿性鏈球菌溶血素O和人視黃醇結(jié)合蛋白的表達與純化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《南京師范大學》 2015年

化膿性鏈球菌溶血素O和人視黃醇結(jié)合蛋白的表達與純化

齊亞坤  

【摘要】：目前,表達外源基因時一般會首先選擇大腸桿菌表達系統(tǒng),但是外源基因在大腸桿菌(Escherichia coli,E. coli)中高效表達時容易形成包涵體。本文選取兩種不同來源的基因,嘗試從不同的方面去解決它們在宿主菌中高效表達時形成包涵體的問題�；撔枣溓蚓苎豋 (Streptolysin O, SLO)是含-SH基的蛋白質(zhì),對紅細胞等多種細胞有損傷作用,有較強的抗原性,能引起咽炎、風濕熱及急性腎小球腎炎等疾病。本文從化膿性鏈球菌中克隆編碼SLO的基因,去掉了N端70個氨基酸長度的堿基序列,在熱激表達載體pHsh中,重組蛋白SLO的表達量較低并且大部分在沉淀當中,降低誘導溫度和設(shè)置不同的誘導時間后,表達量低和形成包涵體的問題沒有明顯改善。在冷激表達載體pEXC中,重組蛋白SLO的表達量明顯提高,同時全部是可溶性表達。接著對重組蛋白SLO的表達進行了一系列的表達優(yōu)化：首先是選取不同的表達宿主,在四種表達宿主Ecoli DH10B、Ecoli JM109。E.coli BL21、 E.coli TOP10中分別進行表達,SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)在Ecoli BL21中重組蛋白的表達量最高；其次是N端二級結(jié)構(gòu)優(yōu)化,軟件預測發(fā)現(xiàn)核糖體結(jié)合位點和翻譯起始位點均形成了發(fā)卡結(jié)構(gòu),通過基因定點誘變解開發(fā)卡結(jié)構(gòu),但是經(jīng)過SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)重組蛋白的表達量并沒有明顯提高；最后是稀有密碼子的優(yōu)化,對編碼SLO的基因進行軟件預測,發(fā)現(xiàn)對于宿主大腸桿菌,基因序列共有20處密碼子偏好性較低,選取兩處進行同義突變,經(jīng)過SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)重組蛋白的表達量并沒有明顯提高。經(jīng)Ni親和層析和DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析純化后,純化得到SLO的產(chǎn)量約18 mg(1 L的LB培養(yǎng)基中),Western Blot分析,發(fā)現(xiàn)純化的重組SLO蛋白與小鼠抗6×His抗體有很高的特異性反應(yīng),,同時對純化蛋白進行溶血活性分析,發(fā)現(xiàn)SLO終濃度為80 ng/mL時能完全溶血。人視黃醇結(jié)合蛋白(Retinal binding protein, RBP)是一種疏水性的小分子結(jié)合蛋白,在檢測腎臟和肝臟相關(guān)方面的疾病有很重要的指示作用。本文主要通過構(gòu)建四種不同的大腸桿菌表達質(zhì)粒pHsh-rbp、pHsh-ex-rbp、pEXC-rbp、 pTrc99a-rbp和一種粟酒裂殖酵母表達質(zhì)粒peno-GFAT-cpy-rbp,在大腸桿菌中運用了熱激、冷激、分泌型、IPTG四種不同的表達方式,并在各自表達條件下設(shè)置一系列的溫度、誘導時間及誘導起始OD梯度變化,但是這些方式對重組蛋白RBP的可溶性表達并沒有明顯的促進作用。重組蛋白RBP在粟酒裂殖酵母中實現(xiàn)了可溶性的分泌型表達,但是重組蛋白只在EMM培養(yǎng)基中表達,在YES培養(yǎng)基中不表達,對重組蛋白的表達進行稀有密碼子優(yōu)化和誘導時間優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)稀有密碼子優(yōu)化對重組蛋白的表達量沒有明顯的提高,而重組RBP在粟酒裂殖酵母生長到穩(wěn)定期的中后期時候表達量較高。分別對大腸桿菌中冷激誘導表達的RBP和粟酒裂殖酵母中分泌表達的RBP進行純化,最后在1L各自的培養(yǎng)基中得到了約8 mg和10 mg的重組蛋白RBP,分別用鼠抗6×His抗體進行Western Blot分析,兩種方式得到的蛋白均能和抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。

【關(guān)鍵詞】：
【學位授予單位】：南京師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q78
【目錄】：

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本文編號：180443