本文選題：微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶 + 穩(wěn)定性��； 參考：《華東師范大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(Transglutaminase,簡(jiǎn)稱TGase,EC2.3.2.13)可以催化蛋白質(zhì)或多肽分子發(fā)生交聯(lián)反應(yīng),被廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域。近年來(lái),TGase在生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有新的應(yīng)用,TGase被廣泛的應(yīng)用于蛋白質(zhì)或多肽與DNA、化學(xué)材料、藥用蛋白的特異性結(jié)合,同時(shí)TGase也被開(kāi)發(fā)作為醫(yī)用止血材料。商業(yè)化的TGase主要是茂源鏈霉菌來(lái)源的微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(簡(jiǎn)稱MTGase),但目前市售的MTGase產(chǎn)品純度較低,穩(wěn)定性參差不齊,無(wú)法滿足各個(gè)領(lǐng)域?qū)ζ淦焚|(zhì)的要求,特別是生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。所以如何提高商業(yè)化的MTGase的純度和穩(wěn)定性成為亟待解決的問(wèn)題。為了解決以上存在的問(wèn)題,本研究以茂源鏈霉菌來(lái)源的MTGase為研究對(duì)象,首先建立了快速檢測(cè)和篩選不同穩(wěn)定性MTGase的方法;然后從MTGase結(jié)構(gòu)和純度兩個(gè)方面對(duì)MTGase的穩(wěn)定性進(jìn)行研究;通過(guò)對(duì)不同結(jié)構(gòu)MTGase的研究,得到MTGase異構(gòu)體比例與MTGase穩(wěn)定性之間的關(guān)系;最后對(duì)MTGase進(jìn)行精細(xì)純化,去除了 MTGase中雜質(zhì)對(duì)其穩(wěn)定性的影響,從而得到穩(wěn)定性高、純度高的MTGase。主要結(jié)論如下:1、建立了 MTGase穩(wěn)定性的檢測(cè)及篩選方法。電泳檢測(cè)法:將MTGase溶解于緩沖液A和緩沖液B中,然后進(jìn)行SDS-PAGE或Native-PAGE檢測(cè)。A1/A2或A1/A3與MTGase穩(wěn)定性呈正相關(guān)(A1:緩沖液A中MTGase在SDS-PAGE中條帶面積;A2:緩沖液B中MTGase在SDS-PAGE中條帶面積;A3:緩沖液A中MTGase在Native-PAGE中條帶面積)。37℃保存加速法:液體MTGase在37℃條件下保存1-5天,可以準(zhǔn)確判斷MTGase的穩(wěn)定性。結(jié)合兩個(gè)方法,當(dāng)A1/A2或A1/A3比值大于0.7,則37℃條件下保存5天酶活保存率大于80%;當(dāng)A1/A2或A1/A3比值小于0.2,則37℃條件下保存5天酶活保存率小于60%。因此可以通過(guò)這兩個(gè)方法準(zhǔn)確篩選出穩(wěn)定性高的MTGase。2、發(fā)現(xiàn)并分離得到不同結(jié)構(gòu)的MTGase,即MTGase的異構(gòu)體(MTG I1和MTG 12)。并確立了異構(gòu)體比例與MTGase穩(wěn)定性之間的關(guān)系。用pH介導(dǎo)的陽(yáng)離子交換層析方法分離得到MTGase的異構(gòu)體。并建立了穩(wěn)定性高,可重復(fù)性好的MTGase異構(gòu)體分離方法。具體方法為:以pH5.5 20mM的磷酸緩沖液作為起始緩沖液,將MTGase溶解于相應(yīng)的緩沖液中,pH9.0 20mM的磷酸緩沖液以0-100%、30個(gè)柱體積的條件對(duì)MTGase進(jìn)行洗脫,流速為1mL/min,所用離子交換柱為Hitrap SP FF(1mL)。得到的MTGI1和MTG12的總回收率在80%以上,MTGI1的收率為60-65%,MTG12的收率在15-20%,MTGI1的洗脫pH范圍在5.5-6.5之間,MTG12的洗脫pH范圍在6.6-7.5之間,MTG I1和MTG 12的分離率約1.2。在一定范圍內(nèi),MTG I2/MTGI1的比值與MTGase的穩(wěn)定性呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。3、MTGase異構(gòu)體性質(zhì)的研究。MTG I1和MTG 12分子量均為37.816KDa,N末端四個(gè)序列均為Asp-Ser-Asp-Glu。MTGI1的等電點(diǎn)為7.94,MTGI2的等電點(diǎn)為8.03。30-70℃時(shí),MTG I1的催化活性顯著高于MTG 12,在30℃以下MTG 12的催化活性顯著高于MTG I1;40-60℃時(shí),MTG I1的溫度穩(wěn)定性顯著高于MTG12。MTG I1的最適反應(yīng)pH為6-8,MTG12的最適反應(yīng)pH為5-8,MTG12的最適反應(yīng)pH范圍比MTG I1廣;37℃時(shí),MTG I1的pH穩(wěn)定性范圍為pH5-9,MTG 12的pH穩(wěn)定性范圍為pH5-8,4℃時(shí),MTG I1的pH穩(wěn)定性范圍為pH4-10,MTG 12的pH穩(wěn)定性范圍為pH5-10,MTG I1的pH穩(wěn)定性范圍比MTG 12廣;37℃時(shí),在pH6和pH5范圍內(nèi),MTGI1的穩(wěn)定性顯著高于MTGI2,4℃時(shí),在7pH10和pH5范圍內(nèi),MTG I1的穩(wěn)定性顯著高于MTG 12;說(shuō)明MTG I1的高溫耐受性和酸堿耐受性要明顯高于MTG 12。MTG I1和MTG 12的Vmax分別為0.84U/mL*min和0.56U/mL*min;MTG I1 和 MTG 12 的 Km 值分別為 19.08mM/mL 和 10.49mM/mL;說(shuō)明MTG 12與底物的親和能力高于MTG I1。MTGase中MTG I1和MTG 12的比例和含量是一定的,但MTG I1存在動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象,將MTGase中的MTG 12分離后,MTG I1將繼續(xù)向MTG 12轉(zhuǎn)化,MTG 12則無(wú)法向MTG I1轉(zhuǎn)化。因此,MTG I1的比例越高,MTGase的穩(wěn)定性越高。4、MTGase的精細(xì)純化。用離子強(qiáng)度介導(dǎo)的陰離子交換層析方法對(duì)MTGase進(jìn)行精細(xì)純化,具體方法為:以pH7.0 10mM的磷酸緩沖液作為起始緩沖液,將MTGase溶解于相應(yīng)的緩沖液中,pH7.0 10mM+1M氯化鈉的磷酸緩沖液以0-20%、25個(gè)柱體積的條件對(duì)MTGase進(jìn)行洗脫,流速為1mL/min,所用離子交換柱為Hitrap QFF(1mL)。上樣量為5-10mg,純化得到的MTGase回收率65%,比酶活為23.62U/mg,此方法具有可重復(fù)性。MTGase進(jìn)一步脫鹽和冷凍干燥后,回收率約47%,比酶活為25.88 U/mg。陰離子交換柱體積放大到200 mL時(shí),MTGase回收率達(dá)77%,比酶活達(dá)27.89U/mg。純化得到的MTGase穩(wěn)定性提高,電泳純度達(dá)95%以上。因此,可以通過(guò)此方法可以純化得到純度高、穩(wěn)定性高的MTGase。綜上所述,本研究通過(guò)對(duì)不同批號(hào)MTGase的對(duì)比研究,建立了快速的MTGase穩(wěn)定性檢測(cè)方法,從而可以快速有效的篩選出穩(wěn)定性高的MTGase;通過(guò)對(duì)不同結(jié)構(gòu)MTGase穩(wěn)定性的研究,得到MTGase結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性之間的關(guān)系;為了進(jìn)一步提高M(jìn)TGase的純度和穩(wěn)定性,對(duì)MTGase進(jìn)行精細(xì)純化,并得到穩(wěn)定性高,純度高的MTGase,從而使MTGase更好的應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。
[Abstract]:In recent years , TGase has been widely used in the fields of biotechnology and medicine . The results showed that MTGI1 had a pH range of 6 - 8 , and MTGI1 had a pH range of 5 - 8 , and MTGI1 had a pH range of 5 - 8 , and MTGI1 had a pH range of 5 - 8 , and MTGI1 had a pH range of 5 - 8 , and MTGI1 had a pH range of 5 - 8 and MTGI1 had a pH range of 5 - 8 and MTGI1 had a pH range of 5 - 8 . The stability of MTGI1 was higher than that of MTGI2 . MTGase was purified by ion - intensity - mediated anion exchange chromatography . MTGase was purified by ion - intensity - mediated anion exchange chromatography . In order to improve the purity and stability of MTGase , MTGase with high stability and high purity can be obtained . MTGase with high stability and high purity can be obtained , so that MTGase can be applied to various fields .

【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q936

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1735152