本文選題：DXS基因　切入點：FPS基因　出處：《鄭州大學》2017年碩士論文

【摘要】：萜類化合物在植物代謝產(chǎn)物中種類繁多,除了在植物生長、發(fā)育、殺蟲、避食、防御等方面有著重要的生理和生態(tài)作用外,大多成分還具有應用價值。近年來人們的研究重點逐漸轉移到對其生物合成途徑中關鍵酶的研究。關鍵酶一般位于合成途徑的分支處,催化各種中間體以及后續(xù)產(chǎn)物的合成。有效調(diào)控某些關鍵酶的合成與表達,可以相應提高有關萜類化合物的產(chǎn)量。本實驗主要對萜類合成途徑中關鍵酶基因DXS和FPS進行克隆及生物信息學分析,構建p BI121-DXS、p BI121-FPS和p BI121-DXS-FPS過表達載體,通過煙草遺傳轉化進行基因表達和茄尼醇含量分析,探討茄尼醇代謝的調(diào)控機制。主要獲得以下研究結果:1.首次從普通煙草K326中克隆得到1-脫氧-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)的完整編碼區(qū)序列,長2142 bp,并較全面地對DXS基因與蛋白序列進行了生物信息學分析,結果表明其與枸杞、馬鈴薯、番茄、辣椒等的一致性在85%以上;該酶屬于親水性蛋白,沒有信號肽及跨膜結構域,預測其具有葉綠體轉運肽并定位于葉綠體,含有保守結構域TPP_synthase_N、TPP_PYR_DXS_TK_like、Transketolase_C及多功能結構域PLNO2582特征序列;系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示K326 DXS與多種植物的DXS2家族成員聚集在一個大分支上,在此分支內(nèi)部又與茄科植物DXS2高度聚集在一小支中,推測該基因序列具有DXS2類型基因的功能,參與煙草類萜化合物的代謝過程。2.首次克隆了煙草K326法尼基焦磷酸合酶(FPS)完整編碼區(qū)序列,長1029bp,生物信息學分析表明該核酸和蛋白質(zhì)序列與番茄、辣椒、南非睡茄等的同源性在85%以上;該蛋白的分子質(zhì)量約39.5 k D,屬于穩(wěn)定蛋白及親水性蛋白,不含信號肽和跨膜結構域,具有底物Mg2+結合位點、活性位點、鏈長度決定區(qū)、催化位點等7個結構域。系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示煙草K326 FPS與同茄科的辣椒、番茄、馬鈴薯和催眠睡茄親緣關系最近,聚集在一個大的分支,支持率為100%,并且與其中的煙草屬植物高度聚集在一小支,這與植物系統(tǒng)發(fā)育的親緣關系相一致。推測該基因應該具備異戊烯焦磷酸合酶的功能。3.進行了DXS、FPS基因的3′RACE序列克隆分析,DXS基因3′RACE序列長291 bp;FPS基因3′RACE擴增出兩條分別長235 bp和261 bp的不同序列,BLAST比對分析顯示兩條序列與煙草屬普通煙草其他品種的同源性100%,說明FPS基因序列在煙草種內(nèi)比較穩(wěn)定,不同種間有較小差異,同時也表明煙草K326中FPS基因存在多個基因家族成員。4.DXS基因、FPS基因表達模式分析表明,兩基因在煙草根、莖、葉和花中都有表達,并且表達量均表現(xiàn)出葉莖根花的規(guī)律,與植物類萜合成代謝主要在葉片中相符。5.分別成功構建了單基因過表達載體PBI121-DXS、PBI121-FPS以及雙基因過表達載體PBI121-DXS-FPS,成功進行了煙草遺傳轉化,獲得過表達DXS轉基因煙苗19株,過表達FPS轉基因煙苗23株,雙基因過表達轉基因煙苗8株。6.不同轉基因煙草,旺長期其DXS或FPS表達量均有顯著性增強,雙基因共表達的轉基因植株DXS、FPS基因的表達均小于單基因轉化植株量基因表達量增加的幅度。現(xiàn)蕾期單基因轉化植株DXS、FPS基因表達量均有顯著提高,雙基因共表達轉化植株與單基因轉化植株基因表達增加幅度基本一致。單基因轉化和雙基因共轉化植株都表明,超表達FPS基因的植株更易獲得。旺長期,DXS或FPS單基因轉化煙草均可顯著促進茄尼醇的合成,而雙基因過表達植株茄尼醇含量與非轉基因植株相比無顯著差異。現(xiàn)蕾期,煙草茄尼醇含量顯著高于旺長期;與對照相比,單基因轉化煙草與雙基因轉化煙草茄尼醇含量均顯著增加,雙基因轉化植株的增加效果更顯著。可見茄尼醇代謝受生育期以及基因間互作等多種因素影響,過表達合成途徑中關鍵酶基因可以有效調(diào)控茄尼醇的合成代謝。同時實驗表明茄尼醇含量與基因表達量不是簡單的正相關關系,存在不一致現(xiàn)象,茄尼醇代謝復雜的調(diào)控機制還有待進一步研究。
[Abstract]:Terpenoids in plant metabolites in various species, except in plant growth, development, insecticidal, avoid eating, have important physiological and ecological effects of defense and other aspects, most components also has application value. In recent years, people's research focus gradually shifted to the research on the key enzymes of the biosynthetic pathway in branch. Key enzymes generally located in the synthesis of various catalytic intermediates and synthesis of subsequent products. Synthesis and expression of effective regulation of some key enzymes, can increase the yield of terpene compounds. The experiment of terpenoid synthesis key enzyme genes in the pathway of DXS and FPS cloning and bioinformatics analysis of P construction BI121-DXS, P BI121-FPS and P BI121-DXS-FPS expression vector, genetic transformation of tobacco through analysis of gene expression and the content of solanesol, discuss the regulation mechanism of solanesol metabolism. The main access to Research results: 1. for the first time from the ordinary tobacco K326 cloned 1- deoxy xylulose -5- phosphate synthase (DXS) sequence of the complete encoding region, 2142 BP long, and comprehensively on DXS gene and protein sequences were analyzed by bioinformatics, and the results show that the Chinese wolfberry, Ma Ling potato, tomato, consistent of chili in more than 85%; the enzyme protein is hydrophilic, no signal peptide and transmembrane domain prediction with chloroplast transit peptide and located in chloroplast containing the conserved domains of TPP_synthase_N, TPP_PYR_DXS_TK_like, Transketolase_C and multi functional domains of PLNO2582 sequences; phylogenetic tree analysis showed that K326 DXS with a variety of plants DXS2 family members gathered in a large branch, this branch of internal and Solanaceae plant height of DXS2 gathered in a small, speculated that the gene sequence with DXS2 type gene function in tobacco .2. metabolism of diterpenes was cloned in tobacco K326 farnesyl diphosphate synthase (FPS) sequence, complete encoding region 1029bp, bioinformatics analysis showed that the nucleotide and protein sequences with tomato, pepper, more than 85% homology in South Africa and other Solanaceae; the molecular weight of the protein is about 39.5 K D, which belongs to stable protein and hydrophilic protein without signal peptide and transmembrane domain with substrate Mg2+ binding site, active site, chain length is determined, 7 domains of catalytic sites. The phylogenetic tree analysis showed that tobacco K326 FPS and with the Solanaceae capsicum, tomato, potato and eggplant related recent sleep hypnosis, gathered in a large branch, the support rate of 100%, and the genus highly concentrated in a small branch of the tobacco, which is consistent with the relationship between development of plant system. It is speculated that the gene should have isopentenyl pyrophosphate synthase function .3. DXS, 3 'RACE sequence analysis cloning of FPS gene, DXS gene 3' long sequences of RACE 291 BP; FPS gene 3 'RACE amplified two different sequences were 235 BP and 261 BP, BLAST sequence analysis showed that two sequences and Nicotiana tobacco varieties of other 100% homology. FPS gene sequence is relatively stable in tobacco species, there are small differences in different species, and also indicates the existence of multiple gene family members.4.DXS gene K326 in tobacco FPS gene, FPS gene expression pattern analysis showed that two genes in tobacco roots, stems, leaves and flowers are expressed, and the expression level showed stem root flowers and plants of terpenoid metabolism mainly in leaves in compliance with.5. were successfully constructed. Single gene expression vector PBI121-DXS, PBI121-FPS and the double gene expression vector PBI121-DXS-FPS, the success of the tobacco genetic transformation, won 19 strains of DXS transgenic tobacco seedlings expression, overexpression of FPS transgenic tobacco seedlings of 23 strains, double gene transgenic tobacco seedlings of 8 different strains of.6. transgenic tobacco, growing its DXS or FPS expression were significantly enhanced in transgenic plants, DXS gene co expression, gene expression of FPS were less than single gene transgenic plants quantity gene expression increase. The amplitude of single gene transgenic plants DXS budding stage, FPS gene expression was significantly increased, co expression of transgenic plants and single gene transgenic plants gene expression increased basically. Plants were transferred to the single gene transformation and double gene showed that over expression of FPS gene in plants is obtained more easily Wang. Long, DXS or FPS single gene in transgenic tobacco could significantly promote the synthesis of solanesol, and double gene overexpression plants the content of solanesol and non transgenic plants showed no significant difference. The budding stage, the content of Solanesol in tobacco. Compared with the vigorous; compared with the control, single and double transgenic tobacco transgenic tobacco solanesol content increased significantly, the double gene transgenic plants increased more significant effect. The visible solanesol metabolism by stages and interaction among genes and other factors, the over expression of metabolism as the key enzyme in the pathway the gene can effectively control the solanesol. The experiments show that the content of solanesol and gene expression is not a simple positive correlation, are inconsistent, the regulation mechanism of solanesol metabolism remains to be further studied.

【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q943.2

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本文編號：1728326