本文選題：Junctophilin　切入點(diǎn)：2　出處：《鄭州大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：1研究背景與目的:JPH2基因編碼的Junctophilin-2是心臟Junctophilins(JPs,JPHs)家族中參與形成膜耦聯(lián)復(fù)合體的蛋白成員,是與心肌細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)信號(hào)操縱相關(guān)的蛋白分子。已有研究表明,小鼠JPH2敲除會(huì)導(dǎo)致其胚胎期致死,心臟出現(xiàn)不規(guī)則鈣信號(hào),以及與SR鈣釋放分離的異常收縮。表明JPH2在促進(jìn)SR鈣釋放和心肌收縮中起著關(guān)鍵作用。在心肌肥大模型中,JPH2表達(dá)的下調(diào)與L-型Ca~(2+)通道和RyR2之間的耦聯(lián)缺陷有關(guān)。提示JPH2可能與細(xì)胞膜上電壓門控鈣離子通道和肌漿網(wǎng)膜ryanodine受體之間的功能耦聯(lián)有關(guān)。小電導(dǎo)-Ca~(2+)-激活K~+通道(small-conductance calcium-activated potassium channel SK,Kca2)屬于非電壓依賴性,幾乎可表達(dá)在所有可興奮細(xì)胞。根據(jù)對(duì)特異性阻斷劑apamin敏感性的不同,SK通道可以被分為SK1,SK2,SK3和SK4四種亞型。SK1一般存在于神經(jīng)組織中,SK2和SK3既存在于神經(jīng)組織也存在于外周組織。作為鈣激活的鉀通道,心肌細(xì)胞上的SK2通道對(duì)胞漿中的鈣離子具有高度敏感性,可通過細(xì)胞內(nèi)低鈣離子濃度而被激活,從而整合Ca~(2+)濃度和膜電位的變化。細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)來源主要包括兩條途徑:通過電壓門控Ca~(2+)通道(voltage-gated Ca~(2+)channels,VGCCs)激活從細(xì)胞外進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的Ca~(2+)及通過心肌肌質(zhì)網(wǎng)(sarcoplasmic,SR)膜上的蘭尼堿受體(ryanodine receptors,RyRs)激活釋放儲(chǔ)存的Ca~(2+)。之前,我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)論證了心肌RyR2敏感的Ca~(2+)釋放通道可以調(diào)控心肌SK2通道介導(dǎo)的Ca~(2+)激活K~+(Ik,Ca)電流,但對(duì)RyR2和SK2通道之間功能耦合的具體分子機(jī)制并不清楚。JPH2是否是心肌SK2通道與RyR2之間膜耦聯(lián)的關(guān)鍵分子,目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過RNA干擾JPH2基因,并利用腺病毒介導(dǎo)構(gòu)建Ad-JPH2-RNAi重組載體,轉(zhuǎn)染新生小鼠心肌細(xì)胞,采用全細(xì)胞膜片鉗研究了JPH2對(duì)SK2通道介導(dǎo)的Ik,Ca電流的影響。通過給予RyR2激動(dòng)劑-Caffeine,RyR2抑制劑-Ryanodine,以及SR Ca~(2+)ATP酶抑制劑-Thapsigargin,觀察JPH2對(duì)心肌RyR2鈣釋放通道與SK2通道功能性耦聯(lián)的影響。從而為揭示心臟SK通道分子調(diào)控、心臟疾病的預(yù)防策略提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。2材料方法:1)本實(shí)驗(yàn)采用出生1-3天的C57BL/6小鼠(合格證號(hào)為SCXX(京)2012-0001),購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,雌雄不限。2)用實(shí)驗(yàn)室已成功制備的JPH2-shRNA重組腺病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的小鼠心肌細(xì)胞,將細(xì)胞分為3組:正常未轉(zhuǎn)染病毒的對(duì)照組(Ctrl-NC);轉(zhuǎn)染無關(guān)序列腺病毒(Ad-scramble siRNA)對(duì)照組;轉(zhuǎn)染JPH2siRNA序列腺病毒(Ad-JPH2-siRNA)組。3)采用Real-time PCR檢測各組細(xì)胞提取的cDNA樣本中JPH2 mRNA相對(duì)量。4)采用全細(xì)胞膜片鉗記錄感染心肌細(xì)胞SK2通道介導(dǎo)的Ca~(2+)-激活K~+電流(calcium-activated potassium current,Ik,Ca)的變化。將細(xì)胞分為3組:Ctrl-NC,Ad-scramble si RNA和Ad-JPH2-si RNA組。為探討JPH2在SK通道與RyR2功能耦聯(lián)中的作用,又將細(xì)胞分為4組:Ad-scramble siRNA,Ad-JPH2-siRNA,Ad-JPH2-siRNA+Ryanodine+TG以及Ad-JPH2-siRNA+Caffeine組。5)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和處理。采用單因素方差分析比較各組間的顯著性差異。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn),n表示樣本例數(shù)。3結(jié)果:1)采用Real-time PCR檢測各組心肌細(xì)胞JPH2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示:與Ctrl-NC組細(xì)胞相比較,Ad-scramble siRNA組心肌細(xì)胞JPH2 mRNA水平無顯著性差異;Ad-JPH2-siRNA組JPH2 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平與對(duì)照組細(xì)胞相比較,顯著降低,其干擾效率達(dá)到80-90%。2)用全細(xì)胞膜片鉗法記錄Ik,Ca電流結(jié)果顯示:與Ctrl-NC和Ad-scramble siRNA組相比,Ad-JPH2-siRNA組心肌細(xì)胞膜SK2通道Ik,Ca電流顯著減小;預(yù)先給予RyR2受體抑制劑Ryanodine+TG,與Ad-scramble siRNA組相比較,SK2通道介導(dǎo)的Ik,Ca電流被明顯抑制;與Ad-JPH2-siRNA組比較,Ik,Ca電流有減小的趨勢,但組間差異無顯著性。給予RyR2受體激動(dòng)劑Caffeine,與Ad-scramble siRNA組相比較,Ik,Ca電流顯著減小,與Ad-JPH2-siRNA組比較,Ik,Ca電流增大。4小結(jié)siRNA敲減小鼠心肌細(xì)胞JPH2可顯著抑制心肌細(xì)胞JPH2 mRNA的表達(dá),抑制SK2通道Ik,Ca電流;JPH2可通過RyR2 Ca~(2+)釋放通道調(diào)節(jié)SK2通道介導(dǎo)的Ik,Ca。提示JPH2介導(dǎo)了心肌SK2通道和RyR2之間的功能耦聯(lián)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q25

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本文編號(hào)：1721480