發(fā)布時(shí)間：2018-03-06 09:43

  本文選題：海洋球石藻　切入點(diǎn)：海洋球石藻病毒　出處：《集美大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：鞘脂類是目前脂類研究的熱點(diǎn)之一,作為食物中的一種天然成分,鞘脂可以歸為食物中的“功能成分”。海洋球石藻(Emiliania huxleyi)是一種海洋真核浮游植物,能夠產(chǎn)生豐富的次級代謝生物活性物質(zhì)。特別是該藻被特異性病毒(E.huxleyi virus:EhV)感染后能夠合成一系列具有特殊結(jié)構(gòu)的新型鞘脂類活性物質(zhì),這些鞘脂類有望開發(fā)為新型的天然食品和醫(yī)藥資源。EhV86及其宿主EhCCMP1516全基因組測序注釋結(jié)果顯示,EhV86基因組中存在7個(gè)預(yù)測編碼鞘脂類合成途徑(SBP)關(guān)鍵催化酶的基因,包括絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(SPT)、長壽保障基因類蛋白(LAG1)、脂肪酸去飽和酶(FAD)、酯類磷酸酶(LPP)、甾醇去飽和酶(SD)、糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)及跨膜脂肪酸伸長蛋白(TFAE)。正是病毒基因組編碼的這些酶在一定程度上掌控著宿主藻細(xì)胞鞘脂類的代謝,從而合成并積累宿主新型的鞘脂類物質(zhì)。到目前為止,上述幾種酶中只有SPT功能和生化特性進(jìn)行了初步研究,其他幾種鞘脂類代謝途徑中酶的功能和確切位置還有待確定。本論文選擇其中兩種關(guān)鍵酶,即SD和FAD為研究對象,從海洋球石藻病毒EhV99B1基因組中克隆獲得該兩種酶基因,對其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行了系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析;然后通過基因工程技術(shù)初步分析這兩種酶在酵母細(xì)胞鞘脂類代謝途徑中可能的作用;對本實(shí)驗(yàn)室已建立的海洋球石藻遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化改進(jìn)。為進(jìn)一步構(gòu)建海洋球石藻生物反應(yīng)器、合成積累新型鞘脂類資源提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。主要研究結(jié)果如下:(1)應(yīng)用PCR技術(shù)從球石藻病毒EhV99B1基因組中擴(kuò)增獲得上述兩種酶基因。其中甾醇去飽和酶SD基因全長987bp,編碼328個(gè)氨基酸,該蛋白的理論等電點(diǎn)為8.31,分子量為37.83kDa,為疏水性、不穩(wěn)定蛋白,存在6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,不存在信號肽;其二級結(jié)構(gòu)中螺旋含量最多。脂肪酸去飽和酶FAD基因全長963bp,編碼320個(gè)氨基酸,該蛋白的理論等電點(diǎn)為7.26,分子量為37.67kDa,屬于親水性、穩(wěn)定蛋白,存在4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,不存在信號肽;其二級結(jié)構(gòu)中也是螺旋結(jié)構(gòu)含量最多。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示,病毒這兩種基因與宿主球石藻及金色藻屬親緣關(guān)系較近。(2)構(gòu)建了釀酒酵母重組表達(dá)載體pYES2/CT-SD和pYES2/CT-FAD,通過醋酸鋰的方法轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌株INVSc1,對篩選獲得的陽性菌株用D-半乳糖誘導(dǎo)目的基因表達(dá),SDS-PAGE檢測到目的蛋白的表達(dá),其分子量分別為甾醇去飽和酶SD為37.8 kDa,脂肪酸去飽和酶FAD為37.6 kDa。重組酵母細(xì)胞與原始酵母細(xì)胞的總脂薄層層析結(jié)果有較大的差別,表明病毒甾醇去飽和酶SD和脂肪酸去飽和酶FAD能夠改變酵母細(xì)胞中脂類組成及含量變化,具有一定的催化活性。(3)利用基因工程技術(shù)從pBar、pGFP質(zhì)粒和E.huxleyi BOF92基因組中成功克隆了海洋球石藻內(nèi)源性啟動(dòng)子FCP-P基因,終止子FCP-T基因、草銨膦抗生素抗性基因Bar、綠色熒光蛋白基因GFP。以psp73作為基礎(chǔ)載體,利用不同酶切位點(diǎn)成功構(gòu)建了pEhux-I(psp73-FAP-Bar-FAT1-FBP-FAT2)載體和pEhux-II(psp73-FAP-GFP-FAT2)載體;采用PEG介導(dǎo)的方法將兩個(gè)載體共轉(zhuǎn)化海洋球石藻BOF92細(xì)胞,熒光顯微鏡觀察到部分轉(zhuǎn)化細(xì)胞中綠色熒光蛋白基因的表達(dá),通過草銨膦篩選獲得成功轉(zhuǎn)化的藻細(xì)胞株;實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western bloting檢測進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)化細(xì)胞中Bar基因的穩(wěn)定表達(dá)。以上研究結(jié)果初步確定了病毒兩種酶基因表達(dá)產(chǎn)物具有一定的催化活性,優(yōu)化后的球石藻遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)能夠誘導(dǎo)目的基因的穩(wěn)定表達(dá),為進(jìn)一步構(gòu)建含有病毒SD和FAD基因的球石藻工程藻株奠定了基礎(chǔ),也為實(shí)現(xiàn)海洋球石藻新型鞘脂類的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：集美大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q78

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1574318