本文關鍵詞： LncRNA-miRNA-mRNA 相互作用 分子海綿 降解　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：人類的整個基因組中至少有85%左右的DNA能轉錄并合成RNA,但這些RNA中又只有不足2%的RNA可以翻譯成為蛋白質,而余下部分皆不編碼蛋白質,這些RNA就被稱作“非編碼RNA”。隨著相關研究的深入進展,人們發(fā)現非編碼RNA分子能夠在不同的水平,通過多種途徑調節(jié)基因的表達,從而參與細胞、組織乃至整個機體的各項生命過程,從而改變了“一切生命活動以蛋白質為基礎”的觀念。非編碼RNA依照其長度的不同可分為短鏈非編碼RNA、中等長度非編碼RNA以及長鏈非編碼RNA(Long no-coding RNA,LncRNA)。短鏈非編碼RNA長度小于50 nt,中等長度非編碼RNA長度介于50-200 nt,而長非編碼RNA長度大于200 nt。而且近年來研究表明,不同長度的RNA之間存在相互作用,特別是LncRNA與miRNA、miRNA與mRNA、lncRNA與mRNA都存在相互調節(jié)的關系,形成了lncRNA-miRNA-mRNA的相互調控網絡,理清這一復雜而精細的調控網絡,對于揭示RNA分子間的相互作用及闡釋其功能至關重要。第一部分:miRNA加速“分子海綿”lncRNA降解LncRNA指的是一類長度大于200個核苷酸,不編碼蛋白質的長鏈RNA分子�，F已發(fā)現長非編碼RNA在哺乳動物細胞中廣泛表達,成千上萬的長非編碼RNA相繼被鑒定出來,但是人們對它們的分子機制以及功能研究還處在起步階段,目前為止,功能已知的非編碼RNA也只有100多種。長非編碼RNA相比較于編碼蛋白的基因表達水平表達一般要低,保守性也比較差,不形成較大的同源家族。一般認為長非編碼RNA按來源可分為如下幾類:從基因間區(qū)轉錄,從基因的上游區(qū)域轉錄以及基因的反式轉錄產物;從長非編碼RNA的功能上可以將其歸為四類分子:指導分子、誘餌分子、信號分子和骨架分子。長非編碼RNA能夠對細胞的多個生物學活動進行調控,包括轉錄前的表觀遺傳學調控、基因轉錄水平調控、基因的轉錄后調控、細胞的亞結構的構成及染色體重塑的調控、細胞分化和機體的發(fā)育等。此外,研究發(fā)現長非編碼RNA的異常表達與許多重大的人類有聯系,主要包括癌癥、神經系統(tǒng)疾病、糖尿病和自身免疫病等。隨著研究的深入,lncRNA被發(fā)現能夠成為mi RNA的“分子海綿”,即lncRNA通過與miRNA結合,減弱miRNA對靶基因的“沉默效應”,從而對miRNA的靶基因進行調控。因此,lncRNA與miRNA的相互作用關系逐漸成為了一個研究熱點。針對lncRNA與mi RNA之間的相互作用,結合已有研究報道我們提出了三個科學問題:大部分miRNA的穩(wěn)定性比較強,半衰期比較長,那么吸收miRNA的“分子海綿”lncRNA穩(wěn)定性如何;lncRNA與靶mRNA競爭結合miRNA,它們之間的相對豐度是否決定了競爭作用的結果;此外,lncRNA“分子海綿”的作用是否具有普遍性。圍繞這三個提問,我們從lncRNA“分子海綿”功能入手,選取了五個具有“分子海綿”的長非編碼RNA,這些lncRNA都可以通過競爭結合miRNA,調控miRNA靶mRNA。我們選擇了HEK293T和He La細胞作為細胞模型,對細胞內幾種lncRNA和mRNA的半衰期進行檢測。我們使用放線菌素D對細胞內轉錄進行了抑制,然后收集五個時間點(0、4、8、12、24h)的細胞總RNA,qRT-PCR檢測各個時間點lncRNA和靶mRNA的表達量,結果顯示,具有“分子海綿”作用的lncRNA半衰期并不都很長,除lncRNA-UCA1半衰期較長大于24 h,其它lncRNAs半衰期均小于12 h;隨后我們檢測了lncRNA與mRNA的相對豐度,lncRNA與mRNA的相對豐度有高有低,也并非有分子海綿功能的lncRNA其豐度相對于靶mRNA就高;過表達miRNA,檢測lncRNA半衰期,我們發(fā)現過表達miRNA使lncRNA的半衰期大大減短,促進lncRNA的降解;隨后,我們構建了lncRNA-UCA1的過表達載體,我們發(fā)現miR-216b能夠加速細胞內源或者外源過表達的lncRNA-UCA1的降解,而且通過使用miR-216b的抑制劑能夠抑制miR-216b加速降解lncRNA-UCA1的作用。上述結果提示,lncRNA作為miRNA的“分子海綿”的作用是通過lncRNA以堿基互補配對方式與miRNA的靶mRNA競爭miRNA,降低了游離miRNA的含量,從而實現對靶mRNA的調控,同時lncRNA結合miRNA之后,其也作為miRNA一個靶基因,mi RNA降低lncRNA的穩(wěn)定性,促進其降解。第二部分:lncRNA抑制miRNA對非完全匹配靶mRNA的降解miRNA(microRNA)指的是一類長度大約18-22 nt的單鏈非編碼RNA分子,miRNA具有高度保守性、組織的特異性以及時空特異性。miRNA在轉錄后水平調控基因表達,其通過堿基互補與靶mRNA的3’端非翻譯區(qū)域(3’translated region,3’UTR)結合,導致靶mRNA剪切或者翻譯抑制,從而調控靶基因的表達�，F在認為,miRNA主要通過兩種方式對靶基因進行“沉默”,一種是miRNA與靶mRNA 3’UTR區(qū)結合位點完全匹配,引起Ago2(Argonaute 2)蛋白介導的靶mRNA剪切,從而引起mRNA分子的快速降解;而另一種指的是,miRNA與mRNA的3’UTR區(qū)域形成不完全的堿基降解,這時引起靶mRNA的翻譯抑制,以實現靶基因的調控。miRNA已被發(fā)現參與生物體的多項生命活動,其在細胞內基因表達,細胞分裂增殖,細胞分化,細胞凋亡乃至生物體的發(fā)育都起到相當重要的作用,而且miRNA的異常表達與多種疾病也有較為緊密的聯系。LncRNA-GAS5作為miR-21的細胞內天然“分子海綿”,能夠通過與miR-21結合從而吸收miR-21,抑制miR-21對靶基因的作用。PTEN和TPM1是miR-21的非完全匹配靶基因。我們首先在HEK293T細胞和HeLa細胞驗證mi-21能夠通過與PTEN和TPM1非完全互補調控PTEN和TPM1蛋白的表達,但并不影響PTEN和TPM1的mRNA的表達量;此外,過表達miR-21后,qRT-PCR檢測PTEN和TPM1 mRNA的半衰期,發(fā)現它們的半衰期顯著縮短,mi R-21加速PTEN和TPM1 mRNA的降解。通過轉染lncRNA-GAS5的過表達質粒,我們發(fā)現lncRNA-GAS5競爭性的與miR-21結合能夠延長PTEN和TPM1 mRNA的半衰期。上述結果提示我們,lncRNA-GAS5作為miR-21的“分子海綿”能夠抑制miRNA對其非完全匹配靶mRNA PTEN和TPM1的降解。LncRNA與mRNA存在這樣的相互作用,能夠幫助我們理解并完善lncRNA-mi RNA-mRNA調控網絡。第三部分:相關表達載體的構建及表達驗證為了探究mRNA是否能夠調控lncRNA的穩(wěn)定性和豐度,我們需要構建靶mRNA的3’UTR區(qū)表達載體。miR-21靶基因TPM1 3’UTR區(qū)真核過表達載體的構建,miR-216b靶基因FGFR1 3’UTR區(qū)真核過表達載體的構建,以及上述載體的表達驗證;miR-21靶基因PTEN和TPM1 3’UTR熒光素酶載體的構建。結果顯示,這些過表達載體以及熒光素酶載體的構建成功,為后一步更加深入的研究lncRNA-miRNA-mRNA相互作用關系,提供了強有力的工具。
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【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q78

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

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本文編號：1489654