本文關(guān)鍵詞： LncRNA-miRNA-mRNA 相互作用 分子海綿 降解　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：人類的整個(gè)基因組中至少有85%左右的DNA能轉(zhuǎn)錄并合成RNA,但這些RNA中又只有不足2%的RNA可以翻譯成為蛋白質(zhì),而余下部分皆不編碼蛋白質(zhì),這些RNA就被稱作“非編碼RNA”。隨著相關(guān)研究的深入進(jìn)展,人們發(fā)現(xiàn)非編碼RNA分子能夠在不同的水平,通過多種途徑調(diào)節(jié)基因的表達(dá),從而參與細(xì)胞、組織乃至整個(gè)機(jī)體的各項(xiàng)生命過程,從而改變了“一切生命活動(dòng)以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)”的觀念。非編碼RNA依照其長度的不同可分為短鏈非編碼RNA、中等長度非編碼RNA以及長鏈非編碼RNA(Long no-coding RNA,LncRNA)。短鏈非編碼RNA長度小于50 nt,中等長度非編碼RNA長度介于50-200 nt,而長非編碼RNA長度大于200 nt。而且近年來研究表明,不同長度的RNA之間存在相互作用,特別是LncRNA與miRNA、miRNA與mRNA、lncRNA與mRNA都存在相互調(diào)節(jié)的關(guān)系,形成了lncRNA-miRNA-mRNA的相互調(diào)控網(wǎng)絡(luò),理清這一復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),對(duì)于揭示RNA分子間的相互作用及闡釋其功能至關(guān)重要。第一部分:miRNA加速“分子海綿”lncRNA降解LncRNA指的是一類長度大于200個(gè)核苷酸,不編碼蛋白質(zhì)的長鏈RNA分子�，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)長非編碼RNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中廣泛表達(dá),成千上萬的長非編碼RNA相繼被鑒定出來,但是人們對(duì)它們的分子機(jī)制以及功能研究還處在起步階段,目前為止,功能已知的非編碼RNA也只有100多種。長非編碼RNA相比較于編碼蛋白的基因表達(dá)水平表達(dá)一般要低,保守性也比較差,不形成較大的同源家族。一般認(rèn)為長非編碼RNA按來源可分為如下幾類:從基因間區(qū)轉(zhuǎn)錄,從基因的上游區(qū)域轉(zhuǎn)錄以及基因的反式轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物;從長非編碼RNA的功能上可以將其歸為四類分子:指導(dǎo)分子、誘餌分子、信號(hào)分子和骨架分子。長非編碼RNA能夠?qū)?xì)胞的多個(gè)生物學(xué)活動(dòng)進(jìn)行調(diào)控,包括轉(zhuǎn)錄前的表觀遺傳學(xué)調(diào)控、基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、細(xì)胞的亞結(jié)構(gòu)的構(gòu)成及染色體重塑的調(diào)控、細(xì)胞分化和機(jī)體的發(fā)育等。此外,研究發(fā)現(xiàn)長非編碼RNA的異常表達(dá)與許多重大的人類有聯(lián)系,主要包括癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、糖尿病和自身免疫病等。隨著研究的深入,lncRNA被發(fā)現(xiàn)能夠成為mi RNA的“分子海綿”,即lncRNA通過與miRNA結(jié)合,減弱miRNA對(duì)靶基因的“沉默效應(yīng)”,從而對(duì)miRNA的靶基因進(jìn)行調(diào)控。因此,lncRNA與miRNA的相互作用關(guān)系逐漸成為了一個(gè)研究熱點(diǎn)。針對(duì)lncRNA與mi RNA之間的相互作用,結(jié)合已有研究報(bào)道我們提出了三個(gè)科學(xué)問題:大部分miRNA的穩(wěn)定性比較強(qiáng),半衰期比較長,那么吸收miRNA的“分子海綿”lncRNA穩(wěn)定性如何;lncRNA與靶mRNA競爭結(jié)合miRNA,它們之間的相對(duì)豐度是否決定了競爭作用的結(jié)果;此外,lncRNA“分子海綿”的作用是否具有普遍性。圍繞這三個(gè)提問,我們從lncRNA“分子海綿”功能入手,選取了五個(gè)具有“分子海綿”的長非編碼RNA,這些lncRNA都可以通過競爭結(jié)合miRNA,調(diào)控miRNA靶mRNA。我們選擇了HEK293T和He La細(xì)胞作為細(xì)胞模型,對(duì)細(xì)胞內(nèi)幾種lncRNA和mRNA的半衰期進(jìn)行檢測(cè)。我們使用放線菌素D對(duì)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄進(jìn)行了抑制,然后收集五個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0、4、8、12、24h)的細(xì)胞總RNA,qRT-PCR檢測(cè)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)lncRNA和靶mRNA的表達(dá)量,結(jié)果顯示,具有“分子海綿”作用的lncRNA半衰期并不都很長,除lncRNA-UCA1半衰期較長大于24 h,其它lncRNAs半衰期均小于12 h;隨后我們檢測(cè)了lncRNA與mRNA的相對(duì)豐度,lncRNA與mRNA的相對(duì)豐度有高有低,也并非有分子海綿功能的lncRNA其豐度相對(duì)于靶mRNA就高;過表達(dá)miRNA,檢測(cè)lncRNA半衰期,我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miRNA使lncRNA的半衰期大大減短,促進(jìn)lncRNA的降解;隨后,我們構(gòu)建了lncRNA-UCA1的過表達(dá)載體,我們發(fā)現(xiàn)miR-216b能夠加速細(xì)胞內(nèi)源或者外源過表達(dá)的lncRNA-UCA1的降解,而且通過使用miR-216b的抑制劑能夠抑制miR-216b加速降解lncRNA-UCA1的作用。上述結(jié)果提示,lncRNA作為miRNA的“分子海綿”的作用是通過lncRNA以堿基互補(bǔ)配對(duì)方式與miRNA的靶mRNA競爭miRNA,降低了游離miRNA的含量,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶mRNA的調(diào)控,同時(shí)lncRNA結(jié)合miRNA之后,其也作為miRNA一個(gè)靶基因,mi RNA降低lncRNA的穩(wěn)定性,促進(jìn)其降解。第二部分:lncRNA抑制miRNA對(duì)非完全匹配靶mRNA的降解miRNA(microRNA)指的是一類長度大約18-22 nt的單鏈非編碼RNA分子,miRNA具有高度保守性、組織的特異性以及時(shí)空特異性。miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá),其通過堿基互補(bǔ)與靶mRNA的3’端非翻譯區(qū)域(3’translated region,3’UTR)結(jié)合,導(dǎo)致靶mRNA剪切或者翻譯抑制,從而調(diào)控靶基因的表達(dá)�，F(xiàn)在認(rèn)為,miRNA主要通過兩種方式對(duì)靶基因進(jìn)行“沉默”,一種是miRNA與靶mRNA 3’UTR區(qū)結(jié)合位點(diǎn)完全匹配,引起Ago2(Argonaute 2)蛋白介導(dǎo)的靶mRNA剪切,從而引起mRNA分子的快速降解;而另一種指的是,miRNA與mRNA的3’UTR區(qū)域形成不完全的堿基降解,這時(shí)引起靶mRNA的翻譯抑制,以實(shí)現(xiàn)靶基因的調(diào)控。miRNA已被發(fā)現(xiàn)參與生物體的多項(xiàng)生命活動(dòng),其在細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá),細(xì)胞分裂增殖,細(xì)胞分化,細(xì)胞凋亡乃至生物體的發(fā)育都起到相當(dāng)重要的作用,而且miRNA的異常表達(dá)與多種疾病也有較為緊密的聯(lián)系。LncRNA-GAS5作為miR-21的細(xì)胞內(nèi)天然“分子海綿”,能夠通過與miR-21結(jié)合從而吸收miR-21,抑制miR-21對(duì)靶基因的作用。PTEN和TPM1是miR-21的非完全匹配靶基因。我們首先在HEK293T細(xì)胞和HeLa細(xì)胞驗(yàn)證mi-21能夠通過與PTEN和TPM1非完全互補(bǔ)調(diào)控PTEN和TPM1蛋白的表達(dá),但并不影響PTEN和TPM1的mRNA的表達(dá)量;此外,過表達(dá)miR-21后,qRT-PCR檢測(cè)PTEN和TPM1 mRNA的半衰期,發(fā)現(xiàn)它們的半衰期顯著縮短,mi R-21加速PTEN和TPM1 mRNA的降解。通過轉(zhuǎn)染lncRNA-GAS5的過表達(dá)質(zhì)粒,我們發(fā)現(xiàn)lncRNA-GAS5競爭性的與miR-21結(jié)合能夠延長PTEN和TPM1 mRNA的半衰期。上述結(jié)果提示我們,lncRNA-GAS5作為miR-21的“分子海綿”能夠抑制miRNA對(duì)其非完全匹配靶mRNA PTEN和TPM1的降解。LncRNA與mRNA存在這樣的相互作用,能夠幫助我們理解并完善lncRNA-mi RNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。第三部分:相關(guān)表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)驗(yàn)證為了探究mRNA是否能夠調(diào)控lncRNA的穩(wěn)定性和豐度,我們需要構(gòu)建靶mRNA的3’UTR區(qū)表達(dá)載體。miR-21靶基因TPM1 3’UTR區(qū)真核過表達(dá)載體的構(gòu)建,miR-216b靶基因FGFR1 3’UTR區(qū)真核過表達(dá)載體的構(gòu)建,以及上述載體的表達(dá)驗(yàn)證;miR-21靶基因PTEN和TPM1 3’UTR熒光素酶載體的構(gòu)建。結(jié)果顯示,這些過表達(dá)載體以及熒光素酶載體的構(gòu)建成功,為后一步更加深入的研究lncRNA-miRNA-mRNA相互作用關(guān)系,提供了強(qiáng)有力的工具。
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【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q78

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

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