本文關鍵詞：高產(chǎn)紅曲色素低產(chǎn)桔霉素的福建紅曲菌種構建　出處：《福建師范大學》2015年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：紅曲菌(Monascus)我國重要的微生物資源,可以產(chǎn)生紅曲色素、莫納可林K、Y-氨基丁酸、麥角固醇等多種次生代謝產(chǎn)物。然而隨著具有腎毒性、致畸性以及致癌性桔霉素的發(fā)現(xiàn),對我國紅曲產(chǎn)品的生產(chǎn)、出口等造成巨大沖擊。因此,獲得高產(chǎn)色素而低產(chǎn)甚至不產(chǎn)桔霉素紅曲菌株的任務迫在眉睫。本研究通過對福建紅曲霉M-CL培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件進行探究。研究內(nèi)容包括碳源、氮源、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、裝液量、轉(zhuǎn)速等方面,研究結果表明該紅曲菌的最優(yōu)碳源為大米粉,氮源為蛋白胨,培養(yǎng)條件為接種量10%,裝液量50ml/250ml,轉(zhuǎn)速180r/min,發(fā)酵溫度30℃,發(fā)酵時間6天。以福建紅曲霉M-CL為出發(fā)菌株,通過重疊延伸PCR技術融合PtrpC啟動子基因、MpigE基因、TrpC終止子基因,通過雙酶切與連接技術連接融合片段與帶有潮霉素抗性的PSKH質(zhì)粒,從而構建紅曲菌過表達載體HPMT。經(jīng)過測序及雙酶切驗證證實過表達載體構建成功。采用原生質(zhì)體PEG介導轉(zhuǎn)化法進行轉(zhuǎn)化,并對紅曲菌原生質(zhì)體的制備條件進行優(yōu)化,當裂解酶的組合為：0.4%溶菌酶、0.6%蝸牛酶、0.8%纖維素酶,滲透壓穩(wěn)定劑為0.6mol/L MgSO4,酶解溫度為30℃,酶解時間為3h時其原生質(zhì)體的數(shù)目達到最大值。成功轉(zhuǎn)化出發(fā)菌株紅曲霉M-CL后,利用濃度為100μg/ml潮霉素篩選突變菌株。液態(tài)發(fā)酵原始菌株及突變菌株,通過高效液相色譜法測定桔霉素含量,采用紫外分光光度法測色素含量。結果表明過表達菌株較原始菌株桔霉素產(chǎn)量降低了41.8%,而色素產(chǎn)量提高了11%。為了進一步降低紅曲中桔霉素的含量,本實驗通過重疊延伸PCR的方法成功構建了兩端含敲除片段同源臂序列中間為潮霉素抗性基因的敲除組件,通過序列分析,表明我們已經(jīng)成功構建了紅曲菌敲除組件,進一步將轉(zhuǎn)化過表達菌株中,為獲得更優(yōu)的菌種奠定基礎。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：福建師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q93

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本文編號：1352238