本文關(guān)鍵詞：利用大腸桿菌表達(dá)和純化乙型肝炎病毒蛋白HBx　出處：《山東大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： HBx 單體型 蛋白質(zhì)表達(dá)純化 蛋白質(zhì)結(jié)晶

【摘要】：[研究背景]乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)可引發(fā)慢性肝炎、肝硬化等疾病,是引發(fā)肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinomas,HCC)的主要因素之一,嚴(yán)重危害人類健康。乙型肝炎病毒調(diào)節(jié)蛋白(Hepatitis B virus X protein,HBx)是HBV基因編碼的一種高度保守的蛋白,含有154個(gè)氨基酸。文獻(xiàn)報(bào)道,HBx的轉(zhuǎn)錄活性對HBV病毒復(fù)制功能起到非常重要的作用,是病毒DNA復(fù)制的中心調(diào)解器。此外,HBx還參與基因轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、蛋白質(zhì)降解等過程,并在HCC的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。HBx 與 DDB1(damage-specific DNA binding protein 1)相互作用對病毒感染及病毒基因組復(fù)制、基因不穩(wěn)定性及細(xì)胞凋亡均有促進(jìn)作用。2010年,Li,T.等解析出全長DDB1與HBxα螺旋結(jié)構(gòu)域(88-100aa)的復(fù)合物的結(jié)構(gòu),該研究表明HBx通過它高度保守的α螺旋結(jié)構(gòu)域結(jié)合DDB1,與宿主Cul4-DDB1-Roc1泛素連接酶形成新的復(fù)合物。2016年,Decorsiere,A.等發(fā)現(xiàn)HBx通過劫持宿主Cul4-DDB1-Roc1泛素連接酶促進(jìn)Smc5/6的蛋白質(zhì)降解,Smc5/6是一種對HBV基因復(fù)制有抑制作用的復(fù)合物。近些年的研究表明HBx α螺旋結(jié)構(gòu)域以外的區(qū)域同樣對HBV病毒復(fù)制的最大化起到重要作用,但由于缺乏HBx全長蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息,HBx α螺旋結(jié)構(gòu)域以外的區(qū)域是如何結(jié)合相互作用蛋白并且促進(jìn)HBV病毒復(fù)制的機(jī)制尚不清楚。除此以外,與HBx相互作用的蛋白還包括HBxIP(HBx-interactingprotein)、Siah-1(Seven in absentia homolog 1)等。HBxIP的氨基端區(qū)域可有效結(jié)合HBx,而HBx的137-140aa序列則參與結(jié)合HBxIP。HBxIP與HBx相互作用發(fā)生在細(xì)胞分裂的前中期,HBxIP能和HBx的羧基末端特異性地形成復(fù)合物,且兩者一起定位于中心體,最終致使中心體復(fù)制過多進(jìn)一步產(chǎn)生三極或多極紡錘體。據(jù)報(bào)道,Siah-1能夠促進(jìn)HBx的多聚泛素化修飾,并起到降解HBx的作用。Siah-1與HBx的相互作用區(qū)域位于Siah-1的半胱氨酸富集區(qū)(98-135aa)和HBx的轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域(50-136aa)。文獻(xiàn)曾報(bào)道Siah-1可以降解全長HBx,卻不能降解HBx羧基端缺失的突變體。因此,HBx羧基端缺失的突變體更具有促癌作用。HBV基因組在整合到宿主基因組時(shí),時(shí)常會發(fā)生斷裂,產(chǎn)生截短體。2015年,Wu,Q.等在HBV感染后的腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了高表達(dá)的HBx截短體1-127aa與43-154aa。這兩種截短體都能促進(jìn)HBV的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。以往的文獻(xiàn)表明,采用昆蟲細(xì)胞或大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)和純化該蛋白時(shí),無論是全長的HBx還是截短體均以包涵體的形式存在,極少部分以可溶性蛋白的形式存在。在以前的文獻(xiàn)中,HBx蛋白的純化多采用變性-復(fù)性的方法從包涵體中分離出目的蛋白。然而,蛋白質(zhì)變性-復(fù)性過程可能會使蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)受損,尤其是會影響具有多個(gè)半胱氨酸的蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。因此,變性復(fù)性后的HBx并不適合用于蛋白質(zhì)結(jié)晶實(shí)驗(yàn)。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,麥芽糖結(jié)合蛋白(Maltose binding protein,MBP)是一種大腸桿菌的內(nèi)源性的蛋白質(zhì),在大腸桿菌中具有極高的表達(dá)量。在目的蛋白的氨基端添加該標(biāo)簽蛋白時(shí),可以大幅度地提高目的蛋白的可溶性表達(dá)量,并且可以幫助目的蛋白在大腸桿菌中正確折疊并保持原有的活性。但是,MBP-HBx重組蛋白自身會形成多聚體,不僅阻礙蛋白質(zhì)晶體的形成,也無法和它的結(jié)合蛋白在細(xì)胞外相互作用。[研究目的]基于以上研究背景,本研究探討如何利用大腸桿菌系統(tǒng)獲得大量的可溶性的單體型的HBx重組蛋白,通過蛋白質(zhì)結(jié)晶實(shí)驗(yàn)獲得優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)晶體,為今后解析HBx重組蛋白的三維結(jié)構(gòu)、研究HBx與其結(jié)合蛋白之間的相互作用機(jī)制和探討HBx生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)。[研究方法]一、篩選多個(gè)標(biāo)簽蛋白,尋找有助于提高目的蛋白在大腸桿菌中可溶性表達(dá)量的標(biāo)簽蛋白。二、根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,構(gòu)建兩個(gè)較穩(wěn)定的HBx截短體1-127aa與43-154aa,并添加氨基端MBP標(biāo)簽獲得重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒。三、通過Swissmodel軟件預(yù)測HBx形成多聚體的疏水界面,經(jīng)過點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)有利于獲得單體型的重組蛋白的突變型。四、采用親和層析法、離子交換層析法、分子體積排阻色譜法等純化手段大規(guī)模表達(dá)純化最優(yōu)的表達(dá)質(zhì)粒。.五、將純化后所獲得的高濃度、高純度的HBx重組蛋白用于蛋白質(zhì)結(jié)晶實(shí)驗(yàn),經(jīng)過結(jié)晶試劑盒篩選,初步篩選出重組蛋白的結(jié)晶條件。[研究結(jié)果]一、與文獻(xiàn)中報(bào)道的類似,我們發(fā)現(xiàn)添加Gst或His標(biāo)簽蛋白并不能提高HBx重組蛋白的可溶性表達(dá)量和改善蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,但是添加MBP標(biāo)簽蛋白可以明顯的提高重組蛋白的可溶性表達(dá)量。二、經(jīng)過一系列嘗試,我們確定His-MBP-HBx 43-154aa是最佳表達(dá)質(zhì)粒。由于野生型重組蛋白質(zhì)是多聚體,無法結(jié)晶。我們依據(jù)軟件預(yù)測結(jié)果,針對蛋白質(zhì)疏水界面上的若干個(gè)氨基酸依次進(jìn)行突變,最終,我們獲得最佳突變組合是F73D/F132D/V133D。利用這樣的組合,我們可以獲得最多的單體型重組蛋白(單體型比例占34.48%)。三、經(jīng)過一系列蛋白質(zhì)純化實(shí)驗(yàn),我們獲得了高濃度、高純度(10.27mg/ml,目的蛋白比例占72.10%)的HBx重組蛋白。通過結(jié)晶試劑盒篩選,我們初步獲得梭形蛋白質(zhì)晶體,結(jié)晶試劑包含pH 8.5(0.1M Bis-tris propane)、Sodium Citrate(0.1M)和PEG 3350(30%)。晶體生長溫度為20℃,生長周期約14天。[創(chuàng)新點(diǎn)]一、我們通過構(gòu)建多個(gè)HBx重組蛋白質(zhì)粒,發(fā)現(xiàn)His-MBP-HBx43-154aa可溶性蛋白表達(dá)量最高,并且蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好,適合進(jìn)行下一步HBx的大規(guī)模表達(dá)和純化實(shí)驗(yàn)。二、我們首次通過點(diǎn)突變的方法獲得單體型的HBx重組蛋白,用于蛋白質(zhì)結(jié)晶實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過初步的試劑盒篩選,我們獲得了重組蛋白的梭形晶體。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R373.21

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