本文關(guān)鍵詞：基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的谷氨酸棒狀桿菌基因組編輯技術(shù)的研究　出處：《山東大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：谷氨酸棒狀桿菌被廣泛應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)氨基酸、重要有機(jī)酸和生物能源等,是一種高價(jià)值的模式菌株。隨著代謝工程的快速發(fā)展以及全基因組測序技術(shù)的普及,利用基因工程手段改造谷氨酸棒狀桿菌受到越來越多研究者的重視,基因編輯技術(shù)作為有效的基因改造工具,其開發(fā)和應(yīng)用也進(jìn)一步加快了合成生物學(xué)和基因組學(xué)的發(fā)展。以CRISPR-Cas9、單鏈重組等為代表的高效的基因編輯技術(shù),通過在基因組水平上對DNA序列進(jìn)行定點(diǎn)修飾和遺傳改造,能夠?qū)崿F(xiàn)基因表達(dá)調(diào)控、代謝途徑改造的目的。本論文旨在開發(fā)適用于谷氨酸棒狀桿菌的基因組編輯工具,以研究報(bào)道中應(yīng)用比較廣泛的CRISPR-Cas9技術(shù)為基礎(chǔ),選取非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)系統(tǒng)以及單鏈重組系統(tǒng)兩個(gè)案例進(jìn)行了初步應(yīng)用探究。主要研究結(jié)果分兩個(gè)部分,第一部分是在谷氨酸棒狀桿菌中探索了 CRISPR-Cas9結(jié)合NHEJ(CA-NHEJ)進(jìn)行一步刪除基因的應(yīng)用。首先是對CRISPR-Cas9系統(tǒng)進(jìn)行功能驗(yàn)證,通過在表達(dá)該系統(tǒng)的質(zhì)粒上設(shè)計(jì)靶位點(diǎn),構(gòu)建驗(yàn)證載體pECXK99E-Cas9-ffl,將其轉(zhuǎn)入到野生型的谷氨酸棒狀桿菌中。通過使用IPTG誘導(dǎo)Cas9蛋白表達(dá),驗(yàn)證了CRISPR-Cas9可以有效發(fā)揮定點(diǎn)切割功能。然后結(jié)合NHEJ系統(tǒng),構(gòu)建表達(dá)載體pXMJ19-NHEJ,對酶切產(chǎn)生的線性化質(zhì)粒雙鏈斷裂(DSB)進(jìn)行修復(fù),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該系統(tǒng)不僅可以有效修復(fù)DSB并伴隨著基因缺失,與此同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在谷氨酸棒狀桿菌可能存在內(nèi)源修復(fù)系統(tǒng),可以保真性修復(fù)外源線性片段DSB。在驗(yàn)證了以上兩個(gè)系統(tǒng)都能有效發(fā)揮功能的情況下,期望利用CA-NHEJ進(jìn)行基因組目的片段的刪除,但是可能由于表達(dá)強(qiáng)度不夠或內(nèi)源保真修復(fù)系統(tǒng)的干擾,沒能達(dá)到理想的效果,該技術(shù)的實(shí)現(xiàn)還需進(jìn)一步的研究。本論文的第二部分是借助于CRISPR-Cas9產(chǎn)生DSB的能力,進(jìn)行突變重組子的篩選。根據(jù)多元重組(MAGE)的設(shè)計(jì)理念,本研究旨在利用人工合成單鏈DNA(ssDNA)調(diào)控谷氨酸棒狀桿菌目的基因的表達(dá)。首先,構(gòu)建表達(dá)單鏈重組蛋白的載體pXMJ19-RecT,比較了不同來源重組蛋白的效率并擇優(yōu)選擇,通過利用標(biāo)記基因?qū)Χ鄠�(gè)位點(diǎn)的堿基同義突變進(jìn)行驗(yàn)證,證明了單鏈重組技術(shù)的可操作性。然后針對選擇的靶位點(diǎn)合成75 nt大小的ssDNA,在單鏈突變的地方設(shè)計(jì)spacer位點(diǎn),構(gòu)建載體pECXK99ES-Cas9-32k。通過采取前期誘導(dǎo)重組酶的表達(dá),然后共轉(zhuǎn)化ssDNA與篩選質(zhì)粒的策略,在完成單鏈重組后進(jìn)行突變重組子的篩選。最后,通過平板抗性比較及測序驗(yàn)證,統(tǒng)計(jì)篩選出來的重組子正確率約為60%。同時(shí)我們還對CRISPR-Cas9表達(dá)載體的構(gòu)建方法進(jìn)行了設(shè)計(jì)優(yōu)化,借鑒Gloden Gate Assembly的方法連接單個(gè)向?qū)NA(sgRNA)位點(diǎn),以便更高效、快速的完成篩選工作,在能有效改變基因組基因序列的同時(shí)提高了工作效率�；诂F(xiàn)在的研究熱點(diǎn),本研究結(jié)合CRISPR-Cas9與單鏈重組技術(shù)在谷氨酸棒狀桿菌中成功建立了一個(gè)快速、高效、可循環(huán)的基因組編輯技術(shù),為在基因組上進(jìn)行快速的代謝途徑優(yōu)化提供了一組有價(jià)值的遺傳操作工具。雖然CA-NHEJ系統(tǒng)介導(dǎo)基因組DSB修復(fù)結(jié)果不太理想,相信通過進(jìn)一步的探索會得到更為理想的效果。此外,我們在研究中也發(fā)現(xiàn)了谷氨酸棒狀桿菌內(nèi)源存在的保真修復(fù)系統(tǒng),為接下來的工作提供了理論平臺。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q78

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本文編號：1331766