本文關(guān)鍵詞：粘細菌中利用CRISPR-dcas9系統(tǒng)抑制基因表達　出處：《山東大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：粘細菌是原核生物中具有最復(fù)雜社會運動的一類細菌,具有復(fù)雜的細胞行為、多種信號調(diào)控途徑、能產(chǎn)生大量活性次級代謝產(chǎn)物,但其代時長、培養(yǎng)及遺傳操作困難,其基因功能和化合物的生產(chǎn)沒能有效地探究和開發(fā)。CRISPR-cas9是微生物的一種的免疫系統(tǒng),經(jīng)過不斷地發(fā)展,將其改造成了一種新型基因編輯工具。將Cas9蛋白的核酸酶位點突變(變?yōu)閐ead cas9簡稱dcas9)以后,CRISPR-dcas9不能切割靶基因,但能抑制該基因的表達,進而發(fā)展成一種新的基因調(diào)控工具。當在dCas9蛋白上融合不同的效應(yīng)元件時能實現(xiàn)不同的目的,如融合RNA聚合酶的ω亞基,使其在靶基因啟動子上游招募RNA聚合酶,實現(xiàn)靶基因的轉(zhuǎn)錄激活。CRISPR-cas9/dcas9具有無物種限制,基因調(diào)控方式多樣,基因修飾率高,可實現(xiàn)多基因同時調(diào)控操作簡單等優(yōu)點。因此,在粘細菌中引入該系統(tǒng)進行基因功能的探究。論文選用的CRISPR-cas9系統(tǒng)來源于釀膿鏈球菌,cas9基因的GC含量僅為31%,而黃色粘球菌DK1622基因組的平均GC含量為67%,cs9基因在黃色粘球菌中對應(yīng)的轉(zhuǎn)運RNA出現(xiàn)頻率較低。cas9基因經(jīng)過密碼子優(yōu)化后(稱為mxcas9),GC含量提高到61%,密碼子對應(yīng)的轉(zhuǎn)運RNA出現(xiàn)頻率達到最大。mxcas9基因通過Red/et技術(shù)將核酸酶位點突變,再利用整合質(zhì)粒將其插入到細菌基因組。sgRNA利用PZJY41質(zhì)粒表達,該質(zhì)粒由PMF1質(zhì)粒改造而來。利用構(gòu)建的CRISPR-dcas9系統(tǒng)抑制piLA和difA基因時,抑制菌株與野生型菌株表型有顯著差異。抑制0049基因時,抑制菌株和野生菌株之間不形成界限。在粘細菌中構(gòu)建好的CRISPR-dcas9能在一定程度上抑制靶基因的表達,但不能完全沉默基因。為提高CRISPR-dcas9系統(tǒng)的抑制效率,需對CRISPR-dcas9系統(tǒng)進行優(yōu)化。提高CRISPR-dcas9系統(tǒng)對靶基因的抑制效率,首先提高sgRNA和dcas9在細胞中的濃度,將它們的啟動子都改為強啟動子(sgRNA用的是強啟動子pili,僅需更換dcas9啟動子)。更換啟動子后利用該系統(tǒng)抑制pilA基因,pilp基因的表達量并沒有明顯的下降。之后,利用sgRNA靶向同一基因的不同部位,發(fā)現(xiàn)越靠近基因末端,抑制效率越低�？傮w而言,在粘細菌中構(gòu)建的CRISPR-dcas9系統(tǒng)能使靶基因的表達量下降約2/3。丙酰輔酶A和甲基丙二酸單酰輔酶A分別是埃博霉素A和埃博霉素B的底物,它們在細胞中的濃度維持較低水平,利用CRISPR-dcas9系統(tǒng)抑制它們的其他支路以提高埃博霉素的產(chǎn)量。丙酰輔酶A是脂肪酸合成的重要底物,利用CRISPR-dcas9抑制脂肪酸合成酶基因的翻譯起始位點后,與對照菌株相比,埃博霉素A的產(chǎn)量有一定的提高,但埃博霉素總產(chǎn)量卻降低了,原因是菌株的生長受到了明顯影響。利用CRISPR-dcas9抑制脂肪酸合成酶基因的ORF末端,埃博霉素A產(chǎn)量明顯提高,與埃博霉素B產(chǎn)量幾乎相同(ZE9菌株中埃博霉素A:埃博霉素B≈1:3)。甲基丙二酸單酰輔酶A可以被甲基丙二酸單酰輔酶A變位酶和甲基丙酰輔酶A羧基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌镔|(zhì),抑制甲基丙二酸單酰輔酶A,埃博霉素產(chǎn)量下降;抑制甲基丙酰輔酶A羧基轉(zhuǎn)移酶,埃博霉素產(chǎn)量有一定提高。dcas9蛋白融合RNA聚合酶的ω或α亞基后能激活靶基因的轉(zhuǎn)錄,利用系統(tǒng)激活埃博霉素基因簇時,前者能提高埃博霉素產(chǎn)量,后者反而使埃博霉素總產(chǎn)量降低。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q78

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本文編號：1329802