發(fā)布時間：2017-12-24 08:01

  本文關鍵詞：人骨形態(tài)蛋白2在畢赤酵母中的表達和生物活性測定　出處：《天津工業(yè)大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 畢赤酵母 融合表達 生物活性測定

【摘要】：骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2)是轉化生長因子-β超家族成員中最有效的成骨信號分子之一,已被證明是刺激成骨和軟骨再生的較強的骨誘導因子,并且其目前已用于多種骨折的治療,例如骨缺損,非結合性骨折,脊柱融合,骨質疏松和根管手術等。然而直接從骨頭中分離BMPs具有成本高、產量低(1-3 μg/kg)和純化方案復雜等問題,而且不能很好地保持其生物活性。因此選擇基因重組的方式表達BMP2蛋白。為避免大腸桿菌原核表達系統(tǒng)在外源蛋白表達和純化過程中可能發(fā)生的表達率低,包涵體形成,蛋白的不正確折疊和毒性等問題,以巴斯德畢赤酵母真核表達系統(tǒng)作為替代方案,描述了通過體外分泌產生具有生物活性的 rhBMPs。本研究的主要目的是開發(fā)一種高產量和簡易的rhBMP2生產過程。首先對BMP2蛋白進行結構分析,選取編碼其前肽和成熟肽部分的基因作為表達的基因序列,并設計EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點、蛋白純化標簽6×His,成功構建表達質粒PPIC9K-BMP2與pPICZαA-BMP2,線性化表達質粒后分別轉進GS115和X33菌株,并篩選高拷貝菌株誘導表達;其次,對發(fā)酵產物進行SDS-PAGE和Western blot鑒定分析,利用Ni2+-NTA柱純化rhBMP2蛋白,并對誘導時間、甲醇濃度、初始菌濃度、培養(yǎng)基pH等條件進行優(yōu)化,通過Human BMP2 ELISA Kit對rhBMP2進行定量分析,確定最佳表達條件;最后,利用BMP2蛋白對小鼠成肌細胞(C2C12)增殖分化的作用,測定堿性磷酸酶(ALP)活性,MTT法測定細胞的增殖分化能力,進行茜素紅染色觀察鈣沉積情況,并對細胞進行形態(tài)學鑒定分析。結果成功篩選出抗3 mg/mLG418的高拷貝重組菌株GS115/pPIC9K-BMP2,其最佳誘導表達條件為初始菌濃度OD600nm=1.0,甲醇濃度1.0%,誘導培養(yǎng)基pH6.0,誘導72 h,且rhBMP2最高表達量為189.6μg/L,蛋白濃度為10 μg/mL時表現出良好的生物活性,ALP活性最大為40.4 U/L。
【學位授予單位】：天津工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q51

【參考文獻】

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本文編號：1327506