本文關(guān)鍵詞：可降解大米生淀粉的α-淀粉酶AmyP的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系　出處：《安徽大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)可作用于淀粉、多糖及寡糖內(nèi)部的α-1,4-葡萄糖苷鍵,產(chǎn)生α-異頭物構(gòu)型保留的低聚麥芽糖和葡糖糖。α-淀粉酶在淀粉轉(zhuǎn)換成低聚糖的過程中起著非常重要的作用,因此對(duì)于以淀粉作為基本能量來源的有機(jī)體來說是至關(guān)重要的。另外,α-淀粉酶在食品、發(fā)酵、制藥以及生物燃料等工業(yè)領(lǐng)域也得到了廣泛的應(yīng)用。在根據(jù)蛋白質(zhì)的序列同源性分類的CAZy數(shù)據(jù)庫中,GH13家族被認(rèn)為是最主要的α-淀粉酶家族,與GH70和GH77家族共同形成了具有(β/α)8(或稱TIM)桶式折疊催化結(jié)構(gòu)域的GH-H宗族。GH13家族α-淀粉酶具有4-7個(gè)保守的序列區(qū),包括了 Asp-Glu-Asp的催化三聯(lián)體和重要的底物結(jié)合位點(diǎn),且都實(shí)行保留催化機(jī)制。根據(jù)序列相似性的程度,目前在CAZy數(shù)據(jù)庫上將GH13家族分成了42個(gè)亞家族。α-淀粉酶分布于其中的11個(gè)亞家族當(dāng)中,其中GH13_37亞家族是最新建立的。它的建立是基于從海洋宏基因組文庫中篩選到的一個(gè)新穎的細(xì)菌α-淀粉酶AmyP。AmyP能快速偏好降解大米生淀粉,水解淀粉的終產(chǎn)物由葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖組成。AmyP由N-末端的催化結(jié)構(gòu)域和C-末端的淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域SBD組成。目前為止,GH13_37亞家族除了AmyP,還包括56個(gè)假定的成員,這些成員大多數(shù)來自海洋細(xì)菌。為了更好地認(rèn)識(shí)這個(gè)新的亞家族,我們解析了AmyP催化結(jié)構(gòu)域酶活缺失突變體AmyP△SBD-E221Q與麥芽三糖復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu),Glu221是酶的三個(gè)保守催化位點(diǎn)中的一個(gè)。然后基于結(jié)構(gòu)分析構(gòu)建了不同的突變體進(jìn)行了相應(yīng)的生化和酶學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。AmyP△SBD的結(jié)構(gòu)與其他GH13家族αα-淀粉酶的結(jié)構(gòu)相似,由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成,分別是domain A,domain B和domain C。Domain A是典型的包含催化位點(diǎn)的(β/α)8桶結(jié)構(gòu),domain C是由反平行的八股β-折疊片組成,而domain B是目前已報(bào)道的GH13家族α-淀粉酶中最短的,形成一段從domain A伸出的loop,沒有通常位于domain A和domain B之間的鈣離子結(jié)合位點(diǎn)。這樣一個(gè)小的domain B使AmyP△SBD相比其它GH13家族α-淀粉酶呈現(xiàn)一個(gè)更開放的底物結(jié)合口袋,利于生淀粉顆粒表面的接近和生淀粉的水解。Domain B緊鄰活性中心,同樣有助于穩(wěn)固AmyP△SBD活性位點(diǎn)的構(gòu)象和增強(qiáng)酶的熱穩(wěn)定性。另外,四個(gè)半胱氨酸殘基兩兩形成二硫鍵(Cys2-Cys243和Cys359-Cys365),位于domain A中,這在GH13_37亞家族中是保守的。大多數(shù)GH13家族α-淀粉酶在domain A和domain B結(jié)構(gòu)域的界面間存在保守的鈣離子結(jié)合位點(diǎn),參與酶分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定,增強(qiáng)其活性和熱穩(wěn)定性。而AmyP△SBD在Domain A邊緣有兩個(gè)鈣離子結(jié)合位點(diǎn),其中一個(gè)很新穎,靠近-3糖單元結(jié)合位點(diǎn)。因此,鈣離子的結(jié)合有助于增強(qiáng)酶的熱穩(wěn)定性。此外,在底物結(jié)合-3亞位點(diǎn),酶的Tyr36殘基與-3糖單元形成疏水和氫鍵相互作用,這與在水解淀粉的初期,野生型主要產(chǎn)生麥芽三糖,而Y36A突變體主要產(chǎn)生麥芽糖的結(jié)果是完全吻合的。我們的工作第一次對(duì)這個(gè)GH13新亞家族GH13_37提出了結(jié)構(gòu)上的見解,也是第一個(gè)對(duì)可降解生淀粉的細(xì)菌來源的α-淀粉酶的結(jié)構(gòu)描述,為更適合工業(yè)應(yīng)用的淀粉酶的定向改造提供了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q55

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 汪穎;劉源濤;鄭昀昀;彭惠;;α-淀粉酶AmyP中淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域的鑒定[J];微生物學(xué)通報(bào);2013年12期

2 李蘭芬;南潔;蘇曉東;;蛋白質(zhì)晶體學(xué)技術(shù)的發(fā)展與展望[J];生物物理學(xué)報(bào);2007年04期

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本文編號(hào)：1316270