本文關(guān)鍵詞：來(lái)自嗜熱子囊菌的耐熱重組木聚糖酶在巴斯德畢赤酵母中的異源表達(dá)　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 木聚糖酶 熱穩(wěn)定性 異源表達(dá) 巴斯德畢赤酵母

【摘要】：目的通過(guò)在巴斯德畢赤酵母中異源表達(dá)進(jìn)一步提高嗜熱子囊菌木聚糖酶的熱穩(wěn)定性。方法基于巴斯德畢赤酵母的密碼子使用偏倚優(yōu)化原嗜熱子囊菌木聚糖酶基因xyn A的基因序列。構(gòu)建重組質(zhì)粒p GAPZαA-xyn A、p PIC9K-xyn A,經(jīng)線性化處理后電擊轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主畢赤酵母GS115中,構(gòu)建重組菌株。經(jīng)過(guò)含博萊霉素(zeocin)的YPD瓊脂板初篩后,抽提基因組篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。使用博來(lái)霉素濃度梯度YPD瓊脂平板復(fù)篩轉(zhuǎn)化子。采用硫酸銨沉淀、有機(jī)溶劑沉淀、離子交換柱層析、分子篩層析等方法分離、純化重組木聚糖酶。通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳和酶譜實(shí)驗(yàn)確定重組木聚糖酶大小,利用高碘酸硝酸銀染色和Endo H酶處理檢測(cè)重組酶是否為糖蛋白及糖蛋白的類型。以失活的重組木聚糖酶Xyn A作對(duì)照,與重組木聚糖酶Xyn A同樣在Tris-HCl緩沖液(p H8.0)中42°C處理激光打印紙72h,檢測(cè)其脫墨效果。在Tris-HCl緩沖液(p H8.0)中高溫(70~80°C)酶解未處理的玉米芯,溫育36h后測(cè)定其糖化效果。結(jié)果密碼子優(yōu)化后的xyn A基因通過(guò)設(shè)計(jì)、合成,并且在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)。篩選出在木聚糖瓊脂板中形成最大水解透明圈的菌株RX8,用于搖瓶發(fā)酵,并產(chǎn)生40U/ml的木聚糖酶活性。S-75型葡聚糖凝膠層析純化后的重組木聚糖酶比酶活最高,達(dá)到1053U/mg的木聚糖活性。通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳和酶譜實(shí)驗(yàn)確定重組木聚糖酶大小為75k Da。高碘酸-硝酸銀染色法顯示該重組木聚糖酶為糖蛋白,其表觀分子量顯著高于其蛋白理論值,表明該重組木聚糖酶在表達(dá)的過(guò)程中發(fā)生了高度糖基化。重組木聚糖酶Xyn A的最適反應(yīng)條件為75°C和p H 8.0。該酶在100°C下保溫8h仍保持高于80%的酶活性。重組木聚糖酶在Tris-HCl緩沖液(p H8.0)中42°C處理激光打印紙72h的脫墨效果(247%)高于報(bào)道的芽孢桿菌木聚糖酶CKBx1D(200%)。其在高溫酶解過(guò)程(70~80°C)中對(duì)未處理的玉米芯保溫36h后的糖化效率7.44%。此外,該重組木聚糖酶在較寬的p H(4.0~10.0)范圍內(nèi)具有較好的酸堿耐受性和穩(wěn)定性。結(jié)論重組木聚糖酶Xyn A首次在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá),其重組木聚糖酶的耐熱性較原始木聚糖酶得到較大提高。較高的比酶活力和良好的熱穩(wěn)定性使該重組木聚糖酶具有較大的工業(yè)化應(yīng)用潛力及經(jīng)濟(jì)價(jià)值,也為其它耐熱木聚糖酶的研究奠定了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q78;Q55

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 楊浩萌;柏映國(guó);李江;羅會(huì)穎;王亞茹;伍寧豐;范云六;姚斌;;木聚糖酶XYNB的N46D突變、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)變化[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2006年03期

，

本文編號(hào)：1315485