本文關(guān)鍵詞：產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的茂源鏈霉菌的基因轉(zhuǎn)移育種研究

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【摘要】：谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(Transglutaminase,TGase,EC2.3.2.13)是目前應(yīng)用非常廣泛的一種食品添加劑,主要作用是使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián),改變食品的質(zhì)構(gòu)。工業(yè)化生產(chǎn)TGase有著巨大的經(jīng)濟(jì)效益,目前工業(yè)生產(chǎn)中通常使用茂源鏈霉菌發(fā)酵的方法獲得TGase(Microbial transglutaminase,簡(jiǎn)稱MTG),這種方法具有價(jià)格低、周期短、純化簡(jiǎn)便、且生產(chǎn)的MTG無(wú)Ca~(2+)離子依賴性等優(yōu)勢(shì),但是也存在如菌株產(chǎn)量低、熱穩(wěn)定性差等問(wèn)題,而獲得性狀優(yōu)良的菌株是解決這些問(wèn)題關(guān)鍵。本文改變傳統(tǒng)誘變育種思路,通過(guò)基因轉(zhuǎn)移的方法,以產(chǎn)MTG周期短、熱穩(wěn)定性高的菌株HS9和MTG產(chǎn)量高的菌株P(guān)oE為親本菌株,嘗試建立原生質(zhì)體融合和Vector-free DNA電轉(zhuǎn)兩種方法,將兩個(gè)系列菌株的基因整合到一個(gè)細(xì)胞中,使其發(fā)生重組,性狀發(fā)生改變。通過(guò)高通量的篩選,最終成功獲得一株產(chǎn)酶周期短、所產(chǎn)MTG熱穩(wěn)定性高,且產(chǎn)酶量能夠達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)要求的菌株,并對(duì)其發(fā)酵性質(zhì)和產(chǎn)酶熱穩(wěn)定性進(jìn)行研究。主要的研究結(jié)果如下:(1)為選擇基因轉(zhuǎn)移的親本菌株,并對(duì)接下來(lái)的基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ),對(duì)多輪多種誘變得到的突變菌株進(jìn)行研究。菌株P(guān)oTX1通過(guò)誘變得到的突變株(Po系列菌株)中酶活最高的為PoE,達(dá)到8.65U/mL,比HS47誘變得到的突變株(HS系列菌株)更高,其中HS9酶活為4.43U/mL。HS系列菌株的產(chǎn)酶開始時(shí)間比Po系列提前12h,達(dá)到最高酶活時(shí)間提前18h。HS系列菌株所產(chǎn)MTG在溫度為60℃時(shí)的反應(yīng)效率更好,熱穩(wěn)定性更高。兩個(gè)系列的菌株能從菌絲及單菌落形態(tài)、TG基因兩方面區(qū)分。此外,Po系列菌株的細(xì)胞壁肽聚糖含量普遍比HS系列菌株低,且細(xì)胞壁糖類組分中含有葡萄糖,而HS系列菌株則沒(méi)有。(2)在進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)之前,需要對(duì)菌株的原生質(zhì)體制備條件進(jìn)行優(yōu)化,獲得高純度、高形成率的原生質(zhì)體。HS系列菌株的最優(yōu)制備條件為:在YEME培養(yǎng)基中添加34%蔗糖和玻璃珠培養(yǎng)菌絲體,并添加1%甘氨酸提高細(xì)胞壁對(duì)溶菌酶的敏感性,菌絲體培養(yǎng)至36h,以6mg/mL溶菌酶酶解106/mL的菌絲體120min,以 Zn~(2+)、Fe3+、Cu~(2+)、Mn~(2+)、Mo6+5 種微量元素復(fù)合添加在 P buffer 中作為緩沖液,最后500rpm離心去除未酶解的菌絲。Po系列菌株的制備條件基本一致,只有酶解時(shí)間縮短為60min,且用β-葡聚糖酶輔配溶菌酶酶解的差異。通過(guò)優(yōu)化后的方法得到制備效果最好的菌株為HS9,原生質(zhì)體純度為98.87%,形成率為88.15%,以及菌株P(guān)oE,原生質(zhì)體純度為95.73%,形成率為91.27%,故選用這兩個(gè)菌株作為接下來(lái)基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)的親本菌株。(3)原生質(zhì)體融合是基因轉(zhuǎn)移的一種方法。對(duì)HS9原生質(zhì)體紫外滅活2min,對(duì)PoE原生質(zhì)體熱滅活40min,致死率都達(dá)到99%以上。使用50%的PEG-2000誘導(dǎo)滅活后106/mL的原生質(zhì)體融合,融合率達(dá)到96.54%,再生出的菌落中融合子的比例為94.33%,證明雙親滅活法能夠提高篩選融合子的比例。96孔板高通量篩選體系的變異系數(shù)小于20%,故設(shè)定酶活高于對(duì)照菌株酶活的20%為酶活提高,且發(fā)酵3d和4d的結(jié)果能夠區(qū)別產(chǎn)酶時(shí)間,在37℃和60℃測(cè)量酶活的結(jié)果可以區(qū)別熱穩(wěn)定性。初篩中同時(shí)擁有產(chǎn)酶提高、產(chǎn)酶時(shí)間早、熱穩(wěn)定性好三種性狀的菌株所占比例為6.79%,每一批次平均酶活提高比例在1.62%-12.93%之間,疑似高產(chǎn)菌株比例范圍在20.65%-29.86%。(4)Vector-free DNA電轉(zhuǎn)是基因轉(zhuǎn)移的另一種方法。通過(guò)XhoⅠ、EcoRI將全基因組DNA切割,將產(chǎn)紅色色素的菌株M52的DNA電轉(zhuǎn)入HS9的原生質(zhì)體中驗(yàn)證電轉(zhuǎn)成功,并以有色菌株數(shù)量計(jì)算轉(zhuǎn)化效率。電轉(zhuǎn)的最適受體細(xì)胞為HS9的原生質(zhì)體,最適電壓為1.5kV,最適復(fù)蘇時(shí)間為120min,得到的轉(zhuǎn)化效率為33.8×104CFU/μg。電擊對(duì)菌株本身的發(fā)酵產(chǎn)酶沒(méi)有影響,初篩中同時(shí)擁有產(chǎn)酶提高、產(chǎn)酶時(shí)間早、熱穩(wěn)定性好三種性狀的菌株所占比例為11.92%,每一批次平均酶活提高比例在8.83%-18.10%之間,疑似高產(chǎn)菌株比例范圍在26.41%-37.08%,高于原生質(zhì)體融合得到的比例。(5)對(duì)兩種基因轉(zhuǎn)移方法篩選得到的菌株進(jìn)行驗(yàn)證,vector-free DNA電轉(zhuǎn)獲得的高產(chǎn)菌株中,酶活高于HS9的菌株占比100%,高于PoE的占比56%,產(chǎn)酶較早的占比89%,所產(chǎn)MTG熱穩(wěn)定性好的占比70%,都高于原生質(zhì)體融合獲得的菌株比例。其中DZ10產(chǎn)酶8.06U/mL,相比HS9提高76.75%,且整體發(fā)酵情況和親本菌株中的HS9類似,酶活達(dá)到最高點(diǎn)的時(shí)間比PoE提前20h,可以縮短生產(chǎn)周期,降低生產(chǎn)成本。DZ10所產(chǎn)MTG的最適反應(yīng)溫度為55℃,具有熱穩(wěn)定性好的優(yōu)勢(shì)。綜上,本文建立了茂源鏈霉菌原生質(zhì)體融合以及vector-free DNA電轉(zhuǎn)兩種基因轉(zhuǎn)移育種方法,通過(guò)基因轉(zhuǎn)移和重組,以提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的產(chǎn)量,獲得發(fā)酵性質(zhì)和酶性狀更優(yōu)良的菌株。經(jīng)過(guò)高通量篩選,我們獲得產(chǎn)酶高、產(chǎn)酶周期短、所產(chǎn)MTG熱穩(wěn)定性好的菌株DZ10,對(duì)其發(fā)酵性質(zhì)和熱穩(wěn)定性進(jìn)行分析,為其以應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)MTG奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q93

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