發(fā)布時間：2017-12-17 18:02

  本文關(guān)鍵詞：米根霉α-淀粉酶高麥芽糖生成能力相關(guān)關(guān)鍵蛋白結(jié)構(gòu)的初步研究

  更多相關(guān)文章： 真菌α-淀粉酶 麥芽糖 麥芽三糖 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 定點(diǎn)突變

【摘要】：在高麥芽糖漿的工業(yè)生產(chǎn)過程中,真菌α-淀粉酶催化水解淀粉所生成的終產(chǎn)物中麥芽糖濃度的高低是評價(jià)其應(yīng)用性能的一個重要特征指標(biāo)。目前,真菌α-淀粉酶高麥芽糖生成能力的研究主要集中在酶的底物催化形式等生化性質(zhì)研究階段,而有關(guān)真菌α-淀粉酶結(jié)構(gòu)與其高麥芽糖生成能力之間關(guān)系的研究則未見報(bào)道,即沒有結(jié)合酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析從根本的分子水平上加以研究,使得真菌α-淀粉酶的高麥芽糖生成能力及其作用機(jī)制一直沒有得到合理的闡釋。因而,本文在研究中利用計(jì)算機(jī)輔助模擬分析技術(shù)對米根霉αα-淀粉酶與麥芽三糖進(jìn)行分子對接并選擇可能與該酶的高麥芽糖生成能力相關(guān)的氨基酸殘基進(jìn)行突變及構(gòu)建突變體,分析對比原酶與突變體之間的酶學(xué)性質(zhì)差異,從而確定影響高麥芽糖生成的關(guān)鍵氨基酸。主要研究內(nèi)容包括:(1)利用計(jì)算機(jī)技術(shù)對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬和分析,尋找米根霉α-淀粉酶與麥芽三糖對接后相互作用氨基酸,并模擬突變后的突變體與麥芽三糖對接模擬圖,通過與原酶的對接模擬圖進(jìn)行對比、分析,探究突變體與原酶在對接模擬時模擬圖上顯示的結(jié)構(gòu)的差異,為下一步實(shí)驗(yàn)提供理論基礎(chǔ)及突變位點(diǎn)選擇。(2)通過重疊PCR完成定點(diǎn)突變,構(gòu)建突變體,并對突變體進(jìn)行篩選,進(jìn)一步對突變體進(jìn)行上罐發(fā)酵,在得到發(fā)酵酶液后,對酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析。通過分析酶學(xué)性質(zhì)發(fā)現(xiàn),原酶ROAmy的最適溫度50℃、最適pH為5.5,而突變體YHR(Y80、H286、R333全部突變?yōu)長eu)的最適溫度提高到60℃,最適pH不變,同樣為5.5。突變體H286L的最適作用pH為5.0,比原酶減低了0.5,最適溫度提高到55℃,比原酶提高了 5℃,而Y80L、R333L與原酶相比,并沒有顯著變化。(3)相比于原酶ROAmy,突變體YHR在以淀粉為底物水解8h后,生成的麥芽糖提高了 11.67%,在以麥芽三糖為底物水解8 h后,消耗麥芽三糖生生成麥芽糖時提高了 18.87%,分析Y80L、H286L、R333L以麥芽三糖及淀粉為底物的終產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)突變體H286L在以淀粉為底物時生成麥芽糖提高了10.32%,在以麥芽三糖為底物時生成麥芽糖提高了 16.87%。這些實(shí)驗(yàn),確定了H286的突變(L)對底物轉(zhuǎn)化能力具有提升作用。進(jìn)一步對H286進(jìn)行飽和突變,分析突變體在以麥芽三糖及淀粉時的終產(chǎn)物,可以發(fā)現(xiàn)突變體H286M也有一定的正向突變作用。(4)通過分析ROAmy與麥芽三糖的對接結(jié)果,發(fā)現(xiàn)配體麥芽三糖對接周圍有四個較為特殊的組氨酸氨基酸,以這四個氨基酸為突變點(diǎn),構(gòu)建了4個突變體,分析對接結(jié)果及水解麥芽三糖及淀粉終產(chǎn)物可以發(fā)現(xiàn),除H286外,其他三個組氨酸位點(diǎn)生成的終產(chǎn)物中麥芽糖與原酶相比差異較小,因而這三個組氨酸位點(diǎn)可能并不是產(chǎn)麥芽糖關(guān)鍵氨基酸。(5)通過對部分保守區(qū)域氨基酸進(jìn)行突變,獲得10個突變體,分析這些突變體在水解淀粉及麥芽三糖上與原酶的終產(chǎn)物并與原酶進(jìn)行對比,從對比結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),這10個突變體中僅有D284L及N285L在以淀粉為底物生成麥芽糖時提高了 12.56%、10.84%,在以麥芽三糖為底物生成麥芽糖時提高了 8.38%、7.45%。另外8個突變體在以淀粉及麥芽三糖為底物時,生成的終產(chǎn)物中麥芽糖含量變化不明顯。
【學(xué)位授予單位】：安徽工程大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q936

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 朱平;孔祥禮;包勁松;;抗性淀粉在食品中的應(yīng)用及功效研究進(jìn)展[J];核農(nóng)學(xué)報(bào);2015年02期

2 張曉;高德榮;呂國鋒;吳宏亞;張伯橋;李曼;;糯小麥與其它作物淀粉特性的比較研究[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2013年11期

3 李松;王正祥;;米根霉α-淀粉酶基因的克隆與表達(dá)[J];食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào);2011年05期

4 李松;王正祥;;真菌α-淀粉酶的研究進(jìn)展[J];生物技術(shù)通報(bào);2011年03期

5 杜雙奎;周麗卿;于修燭;李志西;;山藥淀粉加工特性研究[J];中國糧油學(xué)報(bào);2011年03期

6 李海普;李彬;歐陽明;張莎莎;;直鏈淀粉和支鏈淀粉的表征[J];食品科學(xué);2010年11期

7 李海斌;藍(lán)強(qiáng);李公讓;張敬輝;薛玉志;;淀粉酶降解性能研究[J];鉆井液與完井液;2009年04期

8 諶容;陳敏;楊春賢;廖志華;;基于SWISS-MODEL的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)建模[J];生命的化學(xué);2006年01期

9 畢金峰;真菌α-淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)研究[J];糧油食品科技;2005年03期

10 王海燕,秦浚川,王敖全,唐國敏;黑曲霉酸性α-淀粉酶基因和糖化酶基因?qū)I(yè)酒精酵母的整合及其共表達(dá)[J];微生物學(xué)報(bào);2004年04期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李松;米根霉CICIM F0071α-淀粉酶：基因克隆、鑒定與異源表達(dá)[D];江南大學(xué);2011年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 朱中南;米曲霉α-淀粉酶發(fā)酵優(yōu)化、分離純化與酶學(xué)特性的研究[D];福建師范大學(xué);2012年

2 張宿義;酶制劑制麥芽糖的研究[D];重慶大學(xué);2002年

，

本文編號：1301026