本文關(guān)鍵詞：參與DNA損傷應(yīng)答的果蠅miRNA的系統(tǒng)鑒定及其調(diào)節(jié)凋亡功能的初步研究

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【摘要】：維持基因組的穩(wěn)定性對(duì)細(xì)胞和組織發(fā)揮正常功能至關(guān)重要[1]。每天,人體內(nèi)每個(gè)細(xì)胞在內(nèi)源和外源因素作用下可發(fā)生多至105個(gè)DNA損傷。為了應(yīng)對(duì)這些損傷,機(jī)體進(jìn)化出復(fù)雜的系統(tǒng)來(lái)識(shí)別DNA損傷,停止細(xì)胞周期進(jìn)程,調(diào)節(jié)細(xì)胞新陳代謝,修復(fù)DNA損傷,并在損傷不能修復(fù)時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡等。這一系列信號(hào)調(diào)控通路被稱為DNA損傷應(yīng)答通路[2,3]。如果DNA損傷不能及時(shí)、正確的被修復(fù),會(huì)導(dǎo)致堿基突變或染色體的畸變,并最終導(dǎo)致腫瘤等惡性疾病的發(fā)生。嚴(yán)重的DNA損傷也可導(dǎo)致細(xì)胞死亡或細(xì)胞的衰老。在DNA損傷應(yīng)答調(diào)控中,許多DNA損傷應(yīng)答相關(guān)蛋白可以被磷酸化、泛素化、蘇素化、甲基化和乙�；刃揎椪{(diào)節(jié)[4,5]。除了多種酶對(duì)DNA損傷應(yīng)答相關(guān)蛋白的修飾調(diào)節(jié)外,DNA損傷后,非編碼RNA包括微小非編碼RNA(miRNAs)和長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNAs)也可以通過(guò)對(duì)靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)參與DNA損傷應(yīng)答[6]。miRNA是一類長(zhǎng)度在22個(gè)核苷酸左右的非編碼RNA。早期研究指出,敲低miRNA生成和功能發(fā)揮必須的dicer基因和ago2基因后,DNA損傷后細(xì)胞的生存率和細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)阻滯水平會(huì)顯著降低[7,8]。mi RNA發(fā)揮功能的主要方式是通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與靶基因mRNA結(jié)合,從而導(dǎo)致靶基因mRNA降解或mRNA翻譯終止。DNA發(fā)生損傷時(shí),miRNA可以直接調(diào)節(jié)DNA損傷應(yīng)答相關(guān)蛋白的表達(dá)調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)進(jìn)程,也可以通過(guò)調(diào)節(jié)包括p53、E2F在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)進(jìn)程。本研究收取了野生型果蠅w 1118與p53突變果蠅p53 5A-1-42-4小時(shí)胚胎,使用4Gy輻照處理,提取總RNA,寄送公司進(jìn)行RNA-seq分析差異表達(dá)的miRNA。通過(guò)該策略,共鑒定發(fā)現(xiàn)了44個(gè)差異表達(dá)的miRNA;使用qPCR方法,U6 RNA作為內(nèi)參,對(duì)隨機(jī)選出10個(gè)miRNA,包括6個(gè)上調(diào)的miRNA(miR-263b,miR-137,miR-34,miR-375,miR-987,miR-284)和4個(gè)下調(diào)的miRNA(miR-1002,miR-2b-2,miR-7,miR-3)的RNA-seq結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果顯示qPCR結(jié)果與RNA-seq結(jié)果趨勢(shì)一致,進(jìn)一步證實(shí)RNA-seq結(jié)果真實(shí)可信。由于超過(guò)70%的果蠅miRNA已建立突變動(dòng)物,本實(shí)驗(yàn)室由Bloomington果蠅株共享中心獲得了30株mi RNA突變的果蠅株,對(duì)其中的19株純合存活果蠅進(jìn)行了DNA損傷敏感性檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示,10株miRNA突變果蠅對(duì)DNA損傷敏感,2株抵抗,7株與野生型果蠅沒(méi)有差異。使用caspase-3染色,對(duì)10株輻照敏感的miRNA突變果蠅的翅膀胚芽組織(Wing Disc)進(jìn)行檢測(cè),觀察miRNA突變對(duì)DNA損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),輻照導(dǎo)致7株miRNA突變果蠅的凋亡水平顯著提升。使用分析軟件microRNA(http://www.microrna.org)和TargetScan(http://www.targetscan.org)對(duì)mi RNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)果蠅促凋亡基因家族Reaper-Hid-Grim中的grim和sickle,效應(yīng)caspase drice等是這些miRNA的潛在靶基因。本研究為在生物體水平闡明miRNA對(duì)DNA損傷應(yīng)答的響應(yīng)及對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控提供了重要數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q78

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