本文關(guān)鍵詞：黏細(xì)菌、古菌漆酶序列篩選及其部分重組酶酶學(xué)性質(zhì)分析

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【摘要】：漆酶是一種具有廣泛潛在應(yīng)用價(jià)值的多銅氧化酶。漆酶過去被認(rèn)為廣泛存在于植物、昆蟲和真菌中,而近年來,越來越多的細(xì)菌中也發(fā)現(xiàn)了漆酶的存在。黏細(xì)菌是一類重要的資源菌,但與一般細(xì)菌相比,較難分離和純化,因此,黏細(xì)菌中關(guān)于漆酶的研究也較少。古菌常被發(fā)現(xiàn)生活在各種極端自然環(huán)境下,這些特殊的生活習(xí)性和與此相關(guān)的潛在生物技術(shù)開發(fā)前景,一直吸引著人們的注意。在此,我們采用生物信息學(xué)的方法,綜合應(yīng)用BLAST和隱馬爾可夫模型方法對(duì)黏細(xì)菌蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì),并根據(jù)多銅氧化酶的保守銅離子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)一步篩選,獲得候選目的漆酶序列。我們通過構(gòu)建進(jìn)化樹的方法,對(duì)獲得的候選目的漆酶進(jìn)行分類,按照序列特征與類別從中挑選了 9條目的漆酶序列進(jìn)行重組表達(dá)驗(yàn)證。以2-6甲氧基苯酚(DMP)和丁香醛連氮等底物檢測(cè)重組酶的催化活性,成功獲得7個(gè)黏細(xì)菌重組蛋白具有漆酶催化活性。針對(duì)其中1個(gè)對(duì)DMP具有較高氧化活性的重組酶(來自纖維素堆囊菌,命名為rSC-2)。通過Ni-NTA親和層析柱純化rSC-2,測(cè)試其酶學(xué)性質(zhì),最適反應(yīng)溫度為60℃,最適反應(yīng)pH范圍在中性到偏堿性范圍,在60℃孵育1h保留50%以上剩余酶活。這是首次對(duì)黏細(xì)菌漆酶序列進(jìn)行系統(tǒng)性的生物信息學(xué)分析,并實(shí)現(xiàn)纖維堆囊菌Sorang ium cellulosum序列來源的漆酶活性蛋白在大腸桿菌細(xì)胞中的重組表達(dá)。同時(shí),我們利用同樣的信息學(xué)方法對(duì)古菌進(jìn)行了全蛋白質(zhì)組的比對(duì)分析,得到47個(gè)候選目的漆酶序列。從中挑選5個(gè)在大腸桿菌Escherchia coli BL21(DE3)中重組表達(dá)后沒有漆酶活性,分析序列發(fā)現(xiàn)序列中存在糖基化位點(diǎn)、雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)途徑和預(yù)測(cè)斷裂位點(diǎn),需要翻譯后修飾而不能在大腸桿菌系統(tǒng)中異源表達(dá)得到活性蛋白,轉(zhuǎn)入畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115中表達(dá),并用功能板篩選也發(fā)現(xiàn)了 ABTS漆酶活性的重組酶。
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q55;Q93

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

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本文編號(hào)：1283539