本文關(guān)鍵詞：利用結(jié)合Xist第一內(nèi)含子的Tale-dTF建立R6-MEF細(xì)胞系

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【摘要】：X染色體失活是雌性哺乳動物早期胚胎發(fā)育的重要事件,而非編碼基因Xist是X染色體失活的關(guān)鍵調(diào)控因子。XistRNA通過包被即將失活的X染色體并使其發(fā)生沉默。而在分化細(xì)胞的重編程過程中,失活的X染色體伴隨著Xist的下調(diào)而發(fā)生重活化,在ESC中,多能性因子(如NANOG,SOX2和OCT4等)結(jié)合到Xist基因的第一內(nèi)含子區(qū),以穩(wěn)定ESC的多能性狀態(tài)。但有研究報道,Xist的表達(dá)不會因為敲除第一內(nèi)含子而受到影響,也不能提高誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)的制備效率。而結(jié)合于Xist第一內(nèi)含子區(qū)的基于類轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)物的抑制性體外轉(zhuǎn)錄因子(Transcriptional-activator-like effectors based designer Transcription Factors,Tale-dTFs)Repressor 6(以下稱 R6)顯著提高了小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)向iPSC的誘導(dǎo)效率。本研究利用Xist抑制性Tale-dTF R6成功制備了 R6-MEF細(xì)胞系,并通過細(xì)胞生長曲線制備、免疫熒光染色、實時定量PCR及流式細(xì)胞儀篩選分析等技術(shù)手段,證明了該R6-MEF細(xì)胞系具有不同于野生型MEF細(xì)胞系的特點(diǎn),具體如下:1、利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法制備的R6-MEF細(xì)胞形態(tài)類似于低代次的野生型MEF細(xì)胞系,呈短梭狀,而生長速率明顯高于野生型MEF細(xì)胞系;R6-MEF細(xì)胞系可傳至50代以上,且未見明顯異常。2、實時定量PCR結(jié)果顯示,R6-MEF中的多能性基因Nannog、Sox2、Oct4及生殖相關(guān)基因Prdm14均有不同程度的上調(diào);但R6-MEF中NANOG的免疫熒光染色結(jié)果呈陰性;而雌性R6-MEF中H3K27me3的免疫熒光染色結(jié)果顯示,R6在一定程度上降低了該表觀遺傳修飾的印跡水平。3、流式細(xì)胞分選結(jié)果顯示,野生型MEF細(xì)胞系中的GOF-GFP呈陰性,而R6-MEF細(xì)胞系中的GOF-GFP呈弱陽性。4、核型分析結(jié)果顯示,R6-MEF細(xì)胞與野生型小鼠胎兒成纖維細(xì)胞(MEF)的染色體均為40條,未見明顯異常。綜上所述,R6-MEF細(xì)胞系是介于野生型MEF細(xì)胞和多能性干細(xì)胞(比如誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞)之間的一種新型細(xì)胞系,而這種細(xì)胞系的多能性遠(yuǎn)遠(yuǎn)弱于目前已建立的多能性干細(xì)胞。因此,該R6-MEF細(xì)胞系是一種更接近于野生型MEF細(xì)胞系的、可傳50代次以上(以下稱無限增殖)的新型細(xì)胞系。這種潛在的細(xì)胞特性為干細(xì)胞研究和動物育種模型的建立提供了新思路。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q23

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本文編號：1275307