本文關(guān)鍵詞：Cytophaga hutchinsonii纖維素降解關(guān)鍵基因和高效啟動子序列的篩選鑒定

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【摘要】：纖維素作為植物生物質(zhì)的主要構(gòu)成成分,是極為重要的可再生資源,而在長期進化過程中形成的抗降解屏障使其尚未得以有效利用。自然界中存在眾多可降解纖維素的微生物,其中好氧革蘭氏陰性細菌Cytophaga hutchinsonii具有高效的結(jié)晶纖維素降解能力,但其降解機制至今仍是未解之謎。為了研究C.hutchnsonii獨特的纖維素降解機制,本論文主要從以下兩個方面進行了研究工作:一方面通過正反向遺傳手段對基于生物學信息學分析和轉(zhuǎn)座誘變得到的基因進行定點插入失活,檢測突變株纖維素的利用情況,來篩選鑒定C.hutchinson.中參與纖維素降解利用的重要功能基因;另一方面通過檢測C.hutchinsoniii內(nèi)源基因啟動子驅(qū)動報告基因表達的能力,獲得可用于基因回補及蛋白表達的高效啟動子序列,以進一步完善其遺傳操作體系。本文的主要研究結(jié)果如下:一、構(gòu)建TonB依賴受體編碼基因chu_0089的插入失活突變株,發(fā)現(xiàn)突變株在纖維素利用上表現(xiàn)出顯著延遲,表明該基因在纖維素降解過程中發(fā)揮著重要的作用。我們通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),chu_0089在突變株T127(chu_1276插入失活菌株,纖維素利用缺陷)中相對于野生型菌株表現(xiàn)出特異性下調(diào)。Chu_0089注釋為外膜通道蛋白TonB依賴受體的編碼基因。為了研究chu_0089在纖維素降解中的作用,我們對chu_0089進行了定點插入失活。生長檢測發(fā)現(xiàn)突變株在葡萄糖上的生長沒有受到影響,而在纖維素和纖維二糖的生長上均表現(xiàn)出明顯的延遲現(xiàn)象。Chu_0089的回補能夠恢復(fù)突變株的纖維素利用能力,證明突變株的纖維素利用延遲是由chu_0089的特異性插入失活導(dǎo)致,chu_0089在菌株纖維素利用中發(fā)揮著重要作用。二、通過轉(zhuǎn)座誘變篩選鑒定到兩個可能與甲硫氨酸合成相關(guān)的基因chu_0694和chu_1812,它們在纖維素降解過程中發(fā)揮著重要的作用。利用轉(zhuǎn)座子pHimarEM1誘變,篩選到兩株纖維素利用缺陷菌株T950和T964,質(zhì)粒拯救發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子插入位點分別是chu_0694和chu_1812。通過Southern blot驗證,轉(zhuǎn)座突變株中的轉(zhuǎn)座插入位點是專一性的。這兩個基因分別注釋為2-酮-4-丁酸甲硫酯轉(zhuǎn)氨酶(2-keto-4-methylthiobutyrate aminotransferase)和 O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶(O-acetylhomoserine sulfhydrylase)的編碼基因,推測在甲硫氨酸的循環(huán)再生途徑及從頭合成途徑中發(fā)揮著作用。我們分別構(gòu)建了chu_0694和chu_1812的定點插入失活突變株,突變株表現(xiàn)出與轉(zhuǎn)座誘變突變株相同的纖維素利用缺陷表型,表明這兩個基因在纖維素利用中發(fā)揮著重要作用,其在甲硫氨酸合成及纖維素降解中的具體作用機制需要今后進一步探討研究。三、通過檢測C.hutchinsonii中不同內(nèi)源啟動子驅(qū)動報告基因的表達情況,發(fā)現(xiàn)chu_2750的啟動子可有效啟動基因在C.hutchinsonii中的表達。通過轉(zhuǎn)錄組分析及文獻報道,我們在C.hutchinsonii中選取了 15個可能的高水平表達基因的啟動子,以GFP(綠色熒光蛋白)為報告基因檢測了它們的表達啟動能力。結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),chu_2750的啟動子能夠成功啟動GFP的表達,而其它14個基因的啟動子不能實現(xiàn)表達;當以LacZ(β-半乳糖苷酶基因z)為報告基因時,選取的chu_2750及其它3個基因的啟動子均可啟動LacZ的表達,但是以chu_2750啟動子的啟動能力最高。我們利用chu_2750的啟動子成功地實現(xiàn)了chu_0089在其插入失活突變株中的基因回補。該部分研究為內(nèi)源及外源基因在C.hutchinsonii中的組成型表達奠定了良好基礎(chǔ)。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q78

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5 韓如e，

本文編號：1264948