本文關(guān)鍵詞：腸道病毒71型3D蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究

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【摘要】：腸道病毒 71 型(enterovirus71,EV71)是手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)的主要病原體之一,屬小RNA病毒科(Picornaviridae)腸道病毒屬(Enterovirus)成員。作為具有嗜神經(jīng)性的腸道病毒,EV71感染導(dǎo)致的臨床癥狀輕重不一,輕者僅表現(xiàn)為發(fā)熱和手、足、口等處的皰疹等,而嚴(yán)重者可伴發(fā)無(wú)菌性腦膜炎、腦脊髓炎和神經(jīng)源性肺水腫等中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥,甚至引起患兒死亡。目前重癥HFMD多由EV71導(dǎo)致,其致病機(jī)制尚未明了。本課題組前期研究顯示,EV71病毒株SDLY1和SDLY107在病毒復(fù)制能力和毒力上存在差別,強(qiáng)毒株SDLY107的復(fù)制能力及毒力均大于弱毒株SDLY1;3D蛋白作為RNA依賴的RNA聚合酶,在病毒復(fù)制中具有關(guān)鍵作用。因此,本研究利用反向遺傳技術(shù),將弱毒株SDLY1的3D編碼區(qū)置換入強(qiáng)毒株SDLY107中并拯救出重組病毒,通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究3D蛋白在病毒復(fù)制能力和毒力中的作用。同時(shí),本研究利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù),篩選出弱毒株SDLY1和強(qiáng)毒株SDLY107的3D蛋白晶體,后期將通過(guò)X射線衍射解析其晶體結(jié)構(gòu),為3D蛋白毒力位點(diǎn)的定位提供依據(jù)。目的:1.構(gòu)建并拯救重組病毒SDLY107(1-3D),通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究3D蛋白對(duì)病毒復(fù)制能力和毒力的影響。2.篩選出弱毒株SDLY1和強(qiáng)毒株SDLY107的3D蛋白晶體,解析蛋白結(jié)構(gòu)并分析兩株病毒3D蛋白中的突變位點(diǎn)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響,找出有意義的突變位點(diǎn),為3D蛋白毒力位點(diǎn)的定位提供依據(jù)。方法:1.將弱毒株SDLY1的3D編碼區(qū)置換入強(qiáng)毒株SDLY107,利用體外轉(zhuǎn)錄獲取感染性RNA,轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞,盲傳3代拯救出重組病毒SDLY107(1-3D);2.使用 PCR、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和間接免疫熒光試驗(yàn)(indirect immunofluorescence assay,IFA)對(duì)重組病毒進(jìn)行鑒定,測(cè)序驗(yàn)證;使用Vero細(xì)胞收獲重組病毒,用50%終點(diǎn)法測(cè)定病毒滴度;3.使用弱毒株SDLY1株、強(qiáng)毒株SDLY107株和重組病毒SDLY107(1-3D)感染RD細(xì)胞(MOI=100),分別在37℃和39.5℃條件下培養(yǎng),每12h收取細(xì)胞上清,使用qRT-PCR測(cè)定病毒的生長(zhǎng)曲線,比較不同毒株復(fù)制能力的差異;4.使用弱毒株SDLY1株、強(qiáng)毒株SDLY107株和重組病毒SDLY107(1-3D)感染RD細(xì)胞(MOI=10),分別在37℃和39.5℃條件下培養(yǎng),48h后分別通過(guò)乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試驗(yàn)和CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)不同毒株對(duì)細(xì)胞的損傷作用;5.PCR擴(kuò)增SDLY1株和SDLY107株3D片段,分別將其插入原核表達(dá)載體PET32a(+)和pEGX-6P-1中構(gòu)建重組質(zhì)粒;6.將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)DE3中,使用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá),收集菌體進(jìn)行超聲破碎,使用親和層析、離子交換層析和分子篩層析對(duì)含有3D蛋白的上清液進(jìn)行純化,使用坐滴法篩選3D蛋白晶體。結(jié)果:1.重組感染性RNA轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后,接種至第3代觀察到細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect,CPE),PCR、qRT-PCR、間接免疫熒光試驗(yàn)和測(cè)序結(jié)果證實(shí)重組病毒SDLY 107(1-3D)拯救成功;50%終點(diǎn)法得到SDLY1株、SDLY107 株和 SDLY107(1-3D)株的 CCID50 分別為10-6.0/ml、10-6.5/ml和10-6.5/ml;2.不同毒株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定結(jié)果顯示,37℃條件下,重組病毒SDLY107(1-3D)的復(fù)制能力略弱于SDLY107株,略強(qiáng)于SDLY1株;39.5℃條件下,SDLY107株的復(fù)制能力稍有下降,而SDLY1株和SDLY107(1-3D)的復(fù)制能力均顯著下降,SDLY107(1-3D)略強(qiáng)于 SDLY1 株;3.LDH試驗(yàn)和CCK-8試驗(yàn)結(jié)果顯示,37℃條件下,重組病毒SDLY107(1-3D)對(duì)細(xì)胞的損傷作用弱于SDLY107株,強(qiáng)于SDLY1株,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);39.5℃條件下,SDLY1株和SDLY107(1-3D)對(duì)細(xì)胞的損傷作用顯著降低,SDLY107(1-3D)強(qiáng)于SDLY1株,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);4.PCR擴(kuò)增得到的3D片段分別插入原核表達(dá)載體PET32a(+)和pEGX-6P-1中,得到重組質(zhì)粒 PET32a-3D-1、PET32a-3D-107、pEGX-6P-3D-1'和pEGX-6P-3D-107',測(cè)序正確;5.3D蛋白表達(dá)并純化后,得到了高純度、高濃度的3D蛋白樣品,PET32a-3D-1、PET32a-3D-107、pEGX-6P-3D-1'和 pEGX-6P-3D-107'表達(dá)的 3D 蛋白濃度分別為 14.8mg/ml、12.5mg/ml、9.0mg/ml 和 7.0mg/ml;6.PET32a-3D-1和PET32a-3D-107表達(dá)的3D蛋白未觀察到晶體生成;pEGX-6P-3D-1'和pEGX-6P-3D-1077表達(dá)的3D蛋白在0.4mol/L酒石酸鉀鈉條件下觀察到晶體生成。結(jié)論:1.成功構(gòu)建并拯救了重組病毒SDLY107(1-3D),重組病毒SDLY107(1-3D)的復(fù)制能力和毒力均下降,在高溫條件下下降尤為明顯,表明3D蛋白存在影響病毒毒力的位點(diǎn),且毒力位點(diǎn)具有一定的溫度敏感性。2.成功構(gòu)建了 3D蛋白原核表達(dá)系統(tǒng),得到了高純度、高濃度的3D蛋白,通過(guò)晶體篩選獲得了 SDLY1和SDLY107的3D蛋白晶體,為解析兩株病毒的3D蛋白結(jié)構(gòu)并分析3D蛋白中的突變位點(diǎn)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響以找出有意義的突變位點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R373.2

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2 張楚瑜;腸道病毒在水環(huán)境中的分布及其行為[J];生態(tài)學(xué)報(bào);1984年04期

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本文編號(hào)：1263963