本文關鍵詞：腸道病毒71型3D蛋白結構與功能研究

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【摘要】：腸道病毒 71 型(enterovirus71,EV71)是手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)的主要病原體之一,屬小RNA病毒科(Picornaviridae)腸道病毒屬(Enterovirus)成員。作為具有嗜神經性的腸道病毒,EV71感染導致的臨床癥狀輕重不一,輕者僅表現(xiàn)為發(fā)熱和手、足、口等處的皰疹等,而嚴重者可伴發(fā)無菌性腦膜炎、腦脊髓炎和神經源性肺水腫等中樞神經系統(tǒng)并發(fā)癥,甚至引起患兒死亡。目前重癥HFMD多由EV71導致,其致病機制尚未明了。本課題組前期研究顯示,EV71病毒株SDLY1和SDLY107在病毒復制能力和毒力上存在差別,強毒株SDLY107的復制能力及毒力均大于弱毒株SDLY1;3D蛋白作為RNA依賴的RNA聚合酶,在病毒復制中具有關鍵作用。因此,本研究利用反向遺傳技術,將弱毒株SDLY1的3D編碼區(qū)置換入強毒株SDLY107中并拯救出重組病毒,通過體外實驗研究3D蛋白在病毒復制能力和毒力中的作用。同時,本研究利用結構生物學技術,篩選出弱毒株SDLY1和強毒株SDLY107的3D蛋白晶體,后期將通過X射線衍射解析其晶體結構,為3D蛋白毒力位點的定位提供依據(jù)。目的:1.構建并拯救重組病毒SDLY107(1-3D),通過體外實驗研究3D蛋白對病毒復制能力和毒力的影響。2.篩選出弱毒株SDLY1和強毒株SDLY107的3D蛋白晶體,解析蛋白結構并分析兩株病毒3D蛋白中的突變位點對蛋白結構的影響,找出有意義的突變位點,為3D蛋白毒力位點的定位提供依據(jù)。方法:1.將弱毒株SDLY1的3D編碼區(qū)置換入強毒株SDLY107,利用體外轉錄獲取感染性RNA,轉染Vero細胞,盲傳3代拯救出重組病毒SDLY107(1-3D);2.使用 PCR、實時熒光定量 PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和間接免疫熒光試驗(indirect immunofluorescence assay,IFA)對重組病毒進行鑒定,測序驗證;使用Vero細胞收獲重組病毒,用50%終點法測定病毒滴度;3.使用弱毒株SDLY1株、強毒株SDLY107株和重組病毒SDLY107(1-3D)感染RD細胞(MOI=100),分別在37℃和39.5℃條件下培養(yǎng),每12h收取細胞上清,使用qRT-PCR測定病毒的生長曲線,比較不同毒株復制能力的差異;4.使用弱毒株SDLY1株、強毒株SDLY107株和重組病毒SDLY107(1-3D)感染RD細胞(MOI=10),分別在37℃和39.5℃條件下培養(yǎng),48h后分別通過乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試驗和CCK-8試驗檢測不同毒株對細胞的損傷作用;5.PCR擴增SDLY1株和SDLY107株3D片段,分別將其插入原核表達載體PET32a(+)和pEGX-6P-1中構建重組質粒;6.將重組質粒轉化至大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)DE3中,使用IPTG誘導蛋白表達,收集菌體進行超聲破碎,使用親和層析、離子交換層析和分子篩層析對含有3D蛋白的上清液進行純化,使用坐滴法篩選3D蛋白晶體。結果:1.重組感染性RNA轉染Vero細胞后,接種至第3代觀察到細胞病變效應(cytopathic effect,CPE),PCR、qRT-PCR、間接免疫熒光試驗和測序結果證實重組病毒SDLY 107(1-3D)拯救成功;50%終點法得到SDLY1株、SDLY107 株和 SDLY107(1-3D)株的 CCID50 分別為10-6.0/ml、10-6.5/ml和10-6.5/ml;2.不同毒株生長曲線的測定結果顯示,37℃條件下,重組病毒SDLY107(1-3D)的復制能力略弱于SDLY107株,略強于SDLY1株;39.5℃條件下,SDLY107株的復制能力稍有下降,而SDLY1株和SDLY107(1-3D)的復制能力均顯著下降,SDLY107(1-3D)略強于 SDLY1 株;3.LDH試驗和CCK-8試驗結果顯示,37℃條件下,重組病毒SDLY107(1-3D)對細胞的損傷作用弱于SDLY107株,強于SDLY1株,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);39.5℃條件下,SDLY1株和SDLY107(1-3D)對細胞的損傷作用顯著降低,SDLY107(1-3D)強于SDLY1株,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);4.PCR擴增得到的3D片段分別插入原核表達載體PET32a(+)和pEGX-6P-1中,得到重組質粒 PET32a-3D-1、PET32a-3D-107、pEGX-6P-3D-1'和pEGX-6P-3D-107',測序正確;5.3D蛋白表達并純化后,得到了高純度、高濃度的3D蛋白樣品,PET32a-3D-1、PET32a-3D-107、pEGX-6P-3D-1'和 pEGX-6P-3D-107'表達的 3D 蛋白濃度分別為 14.8mg/ml、12.5mg/ml、9.0mg/ml 和 7.0mg/ml;6.PET32a-3D-1和PET32a-3D-107表達的3D蛋白未觀察到晶體生成;pEGX-6P-3D-1'和pEGX-6P-3D-1077表達的3D蛋白在0.4mol/L酒石酸鉀鈉條件下觀察到晶體生成。結論:1.成功構建并拯救了重組病毒SDLY107(1-3D),重組病毒SDLY107(1-3D)的復制能力和毒力均下降,在高溫條件下下降尤為明顯,表明3D蛋白存在影響病毒毒力的位點,且毒力位點具有一定的溫度敏感性。2.成功構建了 3D蛋白原核表達系統(tǒng),得到了高純度、高濃度的3D蛋白,通過晶體篩選獲得了 SDLY1和SDLY107的3D蛋白晶體,為解析兩株病毒的3D蛋白結構并分析3D蛋白中的突變位點對蛋白結構的影響以找出有意義的突變位點奠定基礎。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R373.2

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6 陳鵬;陶澤新;王海巖;宋艷艷;王顯軍;徐愛強;;新型人類腸道病毒的研究進展[J];病毒學報;2013年02期

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本文編號：1263963