本文關鍵詞：NDV7793-HN蛋白在SF9細胞中的表達

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【摘要】：研究背景及目的新城疫病毒(Newcasle disease virus,NDV)屬于禽類病毒,能引起禽類大面積的死亡,給家禽業(yè)造成嚴重的經濟損失。NDV病毒對人類基本不致病,但能殺死腫瘤細胞,已被用于抗腫瘤的生物治療上。2006年以來我們課題組利用從江西省鄱陽湖野鴨分離得到的1株NDV 7793弱毒株進行NDV抗腫瘤治療的系列研究,積累了大量NDV抗腫瘤生物治療基礎研究的經驗。為了能更深入進行研究,我們擬利用真核表達基因工程系統(tǒng)對NDV的表面蛋白進行表達和純化。NDV含有多種蛋白,其中的血凝素神經氨酸酶蛋白(hemagglutinin neuraminidase,HN)是固定在病毒囊膜外表面上的蛋白,具有血凝素和神經氨酸酶的功能,在病毒侵染細胞的過程中,HN起到識別細胞膜表面的唾液酸受體和介導病毒吸附細胞膜的作用。HN不僅是NDV引起禽類致病的主要蛋白,而且在NDV發(fā)揮抗腫瘤功能上起至關重要的作用,研究HN蛋白的功能有重要意義。為了獲得高品質的HN蛋白進行深入的研究,我們將利用昆蟲細胞——草地貪夜蛾卵巢細胞系(SF9)來表達NDV 7793HN蛋白,這是我們實驗室第一次利用SF9細胞表達NDV 7793弱毒株的HN蛋白。方法1.提取NDV7793的RNA,逆轉錄成c DNA,通過PCR將HN基因進行點突變,并將Nco I/Xho I酶切位點引入NDV7793HN基因片段。2.將HN基因片段通過酶切和連接的方法連接到p Fast Bac1 HT B質粒載體,以構建p Fast Bac1 HT B-HN重組質粒,將質粒送測序公司進行測序。3.將測序正確的p Fast Bac1 HT B-HN重組質粒轉化到感受態(tài)細胞DH10Bac TM中,提取HN桿粒,PCR驗證HN桿粒。4.用脂質體轉染試劑將HN桿粒轉入進昆蟲SF9細胞中,培養(yǎng)48小時后收取細胞培養(yǎng)上清,獲得第一代病毒,接著用一代病毒感染SF9細胞,培養(yǎng)60小時后收取細胞培養(yǎng)上清,獲得二代病毒,最后用二代病毒感染SF9細胞,培養(yǎng)72小時后收集細胞,用SDS-PAGE檢測HN蛋白的表達。結果1.從NDV 7793病毒中提取出了病毒的RNA,RNA逆轉錄成了c DNA,PCR擴增出1710bp帶有Nco I/Xho I酶切位點的HN基因片段。2.測序結果表明:p Fast Bac1 HT B-HN質粒構建成功,HN中的Xho I酶切位點被去除。3.從DH10Bac TM細胞其取出HN桿粒,PCR驗證HN桿粒構建成功。4.SDS-PAGE結果顯示在HN桿粒感染的SF9細胞裂解液中比未感染病毒的SF9細胞裂解液在67k Da左右出現了一個明顯的條帶,這與HN的理論分子量吻合。結論我們成功構建并獲得p Fast Bac1 HT B-HN質粒,即HN桿粒,并將該桿粒轉染昆蟲SF9細胞并得到表達的目的蛋白,初步鑒定為HN蛋白,為今后用基因工程技術獲得的HN研究NDV感染宿主細胞(腫瘤細胞)奠定了基礎。
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.65

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