本文關(guān)鍵詞：NDV7793-HN蛋白在SF9細(xì)胞中的表達(dá)

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【摘要】：研究背景及目的新城疫病毒(Newcasle disease virus,NDV)屬于禽類病毒,能引起禽類大面積的死亡,給家禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。NDV病毒對(duì)人類基本不致病,但能殺死腫瘤細(xì)胞,已被用于抗腫瘤的生物治療上。2006年以來(lái)我們課題組利用從江西省鄱陽(yáng)湖野鴨分離得到的1株NDV 7793弱毒株進(jìn)行NDV抗腫瘤治療的系列研究,積累了大量NDV抗腫瘤生物治療基礎(chǔ)研究的經(jīng)驗(yàn)。為了能更深入進(jìn)行研究,我們擬利用真核表達(dá)基因工程系統(tǒng)對(duì)NDV的表面蛋白進(jìn)行表達(dá)和純化。NDV含有多種蛋白,其中的血凝素神經(jīng)氨酸酶蛋白(hemagglutinin neuraminidase,HN)是固定在病毒囊膜外表面上的蛋白,具有血凝素和神經(jīng)氨酸酶的功能,在病毒侵染細(xì)胞的過(guò)程中,HN起到識(shí)別細(xì)胞膜表面的唾液酸受體和介導(dǎo)病毒吸附細(xì)胞膜的作用。HN不僅是NDV引起禽類致病的主要蛋白,而且在NDV發(fā)揮抗腫瘤功能上起至關(guān)重要的作用,研究HN蛋白的功能有重要意義。為了獲得高品質(zhì)的HN蛋白進(jìn)行深入的研究,我們將利用昆蟲細(xì)胞——草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞系(SF9)來(lái)表達(dá)NDV 7793HN蛋白,這是我們實(shí)驗(yàn)室第一次利用SF9細(xì)胞表達(dá)NDV 7793弱毒株的HN蛋白。方法1.提取NDV7793的RNA,逆轉(zhuǎn)錄成c DNA,通過(guò)PCR將HN基因進(jìn)行點(diǎn)突變,并將Nco I/Xho I酶切位點(diǎn)引入NDV7793HN基因片段。2.將HN基因片段通過(guò)酶切和連接的方法連接到p Fast Bac1 HT B質(zhì)粒載體,以構(gòu)建p Fast Bac1 HT B-HN重組質(zhì)粒,將質(zhì)粒送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。3.將測(cè)序正確的p Fast Bac1 HT B-HN重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH10Bac TM中,提取HN桿粒,PCR驗(yàn)證HN桿粒。4.用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將HN桿粒轉(zhuǎn)入進(jìn)昆蟲SF9細(xì)胞中,培養(yǎng)48小時(shí)后收取細(xì)胞培養(yǎng)上清,獲得第一代病毒,接著用一代病毒感染SF9細(xì)胞,培養(yǎng)60小時(shí)后收取細(xì)胞培養(yǎng)上清,獲得二代病毒,最后用二代病毒感染SF9細(xì)胞,培養(yǎng)72小時(shí)后收集細(xì)胞,用SDS-PAGE檢測(cè)HN蛋白的表達(dá)。結(jié)果1.從NDV 7793病毒中提取出了病毒的RNA,RNA逆轉(zhuǎn)錄成了c DNA,PCR擴(kuò)增出1710bp帶有Nco I/Xho I酶切位點(diǎn)的HN基因片段。2.測(cè)序結(jié)果表明:p Fast Bac1 HT B-HN質(zhì)粒構(gòu)建成功,HN中的Xho I酶切位點(diǎn)被去除。3.從DH10Bac TM細(xì)胞其取出HN桿粒,PCR驗(yàn)證HN桿粒構(gòu)建成功。4.SDS-PAGE結(jié)果顯示在HN桿粒感染的SF9細(xì)胞裂解液中比未感染病毒的SF9細(xì)胞裂解液在67k Da左右出現(xiàn)了一個(gè)明顯的條帶,這與HN的理論分子量吻合。結(jié)論我們成功構(gòu)建并獲得p Fast Bac1 HT B-HN質(zhì)粒,即HN桿粒,并將該桿粒轉(zhuǎn)染昆蟲SF9細(xì)胞并得到表達(dá)的目的蛋白,初步鑒定為HN蛋白,為今后用基因工程技術(shù)獲得的HN研究NDV感染宿主細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞)奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：1258315