本文關(guān)鍵詞：鏈狀亞歷山大藻microRNA高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析

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【摘要】：microRNA (Micro ribonucleic acids, miRNAs)是真核生物中普遍存在的一類長(zhǎng)約19-25 nt的內(nèi)源性非編碼小RNA,能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)。作為一類表達(dá)具有時(shí)序性和組織特異性的進(jìn)化上相對(duì)保守的調(diào)節(jié)者,microRNA在生物體的許多生理代謝過(guò)程中都發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用,如細(xì)胞增殖、器官發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和響應(yīng)脅迫等。赤潮是一種全球性的生態(tài)異�，F(xiàn)象和自然災(zāi)害,給人類生產(chǎn)、生活和生態(tài)環(huán)境都來(lái)了嚴(yán)重的損害。隨著海洋環(huán)境污染的逐漸加重,赤潮的發(fā)生次數(shù)、危害面積及帶來(lái)的損害越來(lái)越大,因此,全球的研究者都為赤潮的發(fā)生機(jī)理和防治付出了很多的努力。甲藻是一類重要的赤潮生物,研究者已在生理生態(tài)方面對(duì)甲藻做了很多研究,但赤潮生物爆發(fā)性增殖的分子機(jī)理研究的相對(duì)較少。鏈狀亞歷山大藻是一種全球分布的能產(chǎn)生麻痹性貝毒毒素的典型甲藻,本文利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)該藻延遲期和對(duì)數(shù)期兩個(gè)文庫(kù)進(jìn)行了測(cè)序,共得到38,092,056和32,969,156條raw reads,發(fā)現(xiàn)88個(gè)已知的microRNA,可歸為32個(gè)家族,得到15個(gè)新穎的microRNA以及83個(gè)microRNA前體。其中在兩個(gè)不同的生長(zhǎng)時(shí)期有12差異表達(dá)的microRNA。通過(guò)12個(gè)差異表達(dá)microRNA的靶基因預(yù)測(cè),我們共得到了1813個(gè)靶基因,并對(duì)其進(jìn)行了GO注釋和KEGG功能注釋。osa-miR2876、rgl-miR5139、aca-miR-3p-456915和ae-miR159a均參與DNA復(fù)制或細(xì)胞快速生長(zhǎng)代謝相關(guān)的途徑的調(diào)控,如：細(xì)胞周期,嘌呤、嘧啶的代謝,錯(cuò)配修復(fù)等。同時(shí)rgl-miR5139與藻細(xì)胞的吞噬作用相關(guān),也為甲藻的兼性營(yíng)養(yǎng)能力提供了證據(jù)。此外,從鏈狀亞歷山大藻(Alexandrium catenella)延遲期、對(duì)數(shù)期兩個(gè)小RNA文庫(kù)中選擇了四個(gè)差異表達(dá)的與該藻快速生長(zhǎng)調(diào)控相關(guān)的microRNA (osa-miR2876、rgl-miR5139、aca-miR-3p-456915和ae-miR159a),設(shè)計(jì)f/2培養(yǎng)下延遲期、對(duì)數(shù)期和高氮、高磷、高錳對(duì)數(shù)期五個(gè)條件,以5.8srRNA為內(nèi)參基因,以SYBR Green I為熒光染料,用加尾法熒光定量PCR對(duì)其相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明：osa-miR2876、rgl-miR5139、aca-miR456915-3p均在延遲期有最高的表達(dá)量,osa-miR2876、rgl-miR5139在延遲期的表達(dá)量顯著高于f/2對(duì)數(shù)期和誘導(dǎo)對(duì)數(shù)期,與高通量測(cè)序結(jié)果是一致的；aca-miR456915-3p在延遲期的表達(dá)量與f/2對(duì)數(shù)期的表達(dá)量相當(dāng),高通量測(cè)序得到的延遲期的表達(dá)量是對(duì)數(shù)期的1.21倍,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果基本一致。tae-miR159a在對(duì)數(shù)期及誘導(dǎo)對(duì)數(shù)期的表達(dá)量均顯著高于延遲期,這與測(cè)序結(jié)果是一致的。通過(guò)對(duì)microRNA數(shù)據(jù)中得到的與該藻生長(zhǎng)調(diào)控相關(guān)的四個(gè)microRNA進(jìn)行克隆測(cè)序,確定了序列信息的正確性。并通過(guò)設(shè)置不同的培養(yǎng)條件,對(duì)其表達(dá)進(jìn)行分析,進(jìn)一步證明了microRNA在甲藻中的表達(dá)以及在鏈狀亞歷山大藻中的調(diào)控作用,也為赤潮甲藻爆發(fā)性增殖的分子機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：鏈狀亞歷山大藻 microRNA 高通量測(cè)序 qPCR
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q949.2
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-37
• 1. 赤潮研究概況13-21
• 1.1 赤潮的發(fā)生及其危害13-15
• 1.2 赤潮的發(fā)生與甲藻的關(guān)系15-17
• 1.3 赤潮爆發(fā)機(jī)理的生理生態(tài)及分子生物學(xué)研究現(xiàn)狀17-21
• 2. microRNA研究進(jìn)展21-30
• 2.1 microRNA的起源及加工21-24
• 2.2 microRNA的特征24-25
• 2.3 microRNA的調(diào)控機(jī)制25-26
• 2.4 microRNA在植物中的調(diào)節(jié)作用26-28
• 2.5 microRNA的分離及鑒定方法28-29
• 2.6 檢測(cè)及定量分析microRNA表達(dá)的方法29-30
• 3. microRNA高通量測(cè)序及熒光定量技術(shù)30-36
• 3.1 測(cè)序技術(shù)的發(fā)展30
• 3.2 microRNA高通量測(cè)序技術(shù)30-32
• 3.3 microRNA高通量測(cè)序技術(shù)在藻類中的應(yīng)用32-33
• 3.4 microRNA熒光定量PCR技術(shù)33-36
• 4. 本研究的目標(biāo)和意義36-37
• 第二章 鏈狀亞歷山大藻microRNA的高通量測(cè)序及結(jié)果分析37-60
• 1. 前言37
• 2. 材料和方法37-44
• 2.1 藻種的來(lái)源及培養(yǎng)37-38
• 2.2 實(shí)驗(yàn)所需的試劑及儀器38-39
• 2.3 鏈狀亞歷山大藻的培養(yǎng)和藻細(xì)胞的收集39
• 2.4 總RNA的提取及質(zhì)量檢測(cè)39-41
• 2.5 小RNA文庫(kù)的構(gòu)建41
• 2.6 數(shù)據(jù)過(guò)濾及基礎(chǔ)分析流程41-42
• 2.7 差異表達(dá)microRNA的靶基因預(yù)測(cè)及功能注釋42-44
• 3. 結(jié)果44-56
• 3.1 小RNA文庫(kù)的測(cè)序結(jié)果44-45
• 3.2 小RNA長(zhǎng)度分布45-46
• 3.3 鏈狀業(yè)歷山大藻中保守microRNA的鑒定和分析46-52
• 3.4 鏈狀亞歷山大藻中新穎的microRNA52-53
• 3.5 鏈狀亞歷山大藻不同生長(zhǎng)時(shí)期差異表達(dá)的microRNA53-54
• 3.6 差異表達(dá)的microRNA的靶基因預(yù)測(cè)及其功能注釋54-56
• 4. 討論56-59
• 4.1 鏈狀亞歷山大藻中小RNA長(zhǎng)度分布模式56-57
• 4.2 已知micoRNA在鏈狀亞歷山大藻不同生長(zhǎng)時(shí)期的調(diào)控作用57-58
• 4.3 差異表達(dá)的micoRNA在鏈狀亞歷山大藻不同生長(zhǎng)時(shí)期的調(diào)控作用58-59
• 5. 小結(jié)59-60
• 第三章 鏈狀亞歷山大藻差異表達(dá)的microRNA在不同生長(zhǎng)時(shí)期和生長(zhǎng)狀態(tài)下的qPCR驗(yàn)證60-71
• 1. 前言60
• 2. 實(shí)驗(yàn)所需的材料、試劑及儀器60-61
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料60
• 2.2 實(shí)驗(yàn)試劑60-61
• 2.3 實(shí)驗(yàn)儀器61
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法61-63
• 3.1 鏈狀亞歷山大藻的培養(yǎng)和收集61
• 3.2 引物設(shè)計(jì)61-62
• 3.3 樣本的RNA提取及反轉(zhuǎn)錄62
• 3.4 目的序列的回收和克隆測(cè)序62
• 3.5 qPCR溶解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作62-63
• 3.6 qPCR檢測(cè)基因的差異表達(dá)63
• 4. 結(jié)果與分析討論63-68
• 4.1 一鏈合成效率的檢測(cè)63-64
• 4.2 質(zhì)粒的檢測(cè)64-65
• 4.3 目的基因溶解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作65-67
• 4.4 四個(gè)差異miRNA表達(dá)量的變化67-68
• 5. 討論68-70
• 6. 小結(jié)70-71
• 參考文獻(xiàn)71-85
• 致謝85-86
• 附錄86-88

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