本文關鍵詞：全細胞反應器生產α-熊果苷

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【摘要】：a-熊果苷,一種高效、安全、配伍性強的天然美白活性物質。它比同分異構體β-熊果苷的美白效果更好、更安全。呈白色針狀結晶或粉末,能夠加速黑色素的分解與排泄,進而減少皮膚中黑色素的沉積,祛除色斑和雀斑,同時還有殺菌、消炎的作用,主要用于高級化妝品的制備。熊果苷的合成是當前的一個研究熱點,其合成有多種途徑：天然提取法、植物細胞培養(yǎng)法、有機合成法和生物轉化法等。采用前三種方法合成熊果苷由于分離純化困難、產物含量低、生產成本高而很難實現工業(yè)化生產,故目前生產α-熊果苷一般通過來源于不同微生物的酶進行糖基轉移反應,讓一分子的二糖和一分子的對苯二酚在酶的作用下轉化生成一分子α-熊果苷,利用生物轉化法生產α-熊果苷相比其他方法具有很大優(yōu)勢,但目前國內外關于這方面的研究很少,值得引起我們的注意。本論文將來源于耐輻射球菌Deinococcus radiodurans CGMCC 1.3828的淀粉蔗糖酶基因導入大腸桿菌中,構建基因工程菌株,用該菌株作為催化劑進行全細胞轉化生產α-熊果苷,同時對比兩株基因工程菌TyAS-pet28a-rosetta(本實驗室構建)和DrAS-pet28a-rosetta催化生產α-熊果苷能力的大小,結果表明TyAS-pet28a-rosetta催化生產α-熊果苷的能力比DrAS-pet28a-rosetta要強很多,轉化率是后者的2.92倍,下一步通過優(yōu)化轉化工藝來提高α。熊果苷的產量。本論文主要研究采用全細胞催化法生產a-熊果苷的工藝的優(yōu)化,確定了最佳反應條件為：溫度30℃,對苯二酚濃度180mM,蔗糖和對苯二酚摩爾比為5.5：1,添加0.5mM Vc,反應時間為6h,轉速為150rpm,細胞濃度為300D/mL,反應液為100mM pH7.0的Tris-HCl緩沖溶液。采用此方法來生產α-熊果苷,轉化率可達到99%,產量可達45.36g/L,生產效率為7.56g/L/h,這一水平遠遠好于目前所有文獻中已報道的水平,同時在生產過程中利用蔗糖而不是相對較貴的麥芽糖作為供體,且無需用純酶來進行反應,這樣將大大降低α-熊果苷的生產成本。該方法具有原料價廉、反應條件容易控制、反應周期短、產物純度高、生產效率高等優(yōu)點,具有重要的工業(yè)化意義。分離純化反應液以獲得純度較高的α-熊果苷具有重要的工業(yè)化意義,先把反應液通過大孔吸附樹脂H107進行一步純化,分別收集含不同組分的洗脫液,把含有產物的洗脫液進行濃縮結晶,此時產物的純度為98%以上,通過高效液相色譜(HPLC)檢測,還含有少量對苯二酚,故還需進一步純化。采用硅膠柱進行二步純化,產物經高效液相色譜(HPLC)檢測,純度可達到99.9%以上,通過比較α-熊果苷標準品與產物的高效液相色譜圖發(fā)現,產物出峰時間與a-熊果苷標準品一致均為7.324 min。產物經核磁共振分析其化學結構,最終確定產物為α-熊果苷。
【關鍵詞】：α-熊果苷 全細胞轉化 分離純化 結構鑒定
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q81
【目錄】：

• 中文摘要12-14
• ABSTRACT14-16
• 符號說明16-17
• 第一章 緒論17-28
• 1.1 熊果苷概述17-21
• 1.1.1 熊果苷簡介17-18
• 1.1.2 熊果苷的理化性質18
• 1.1.3 熊果苷的美白機理18-20
• 1.1.4 熊果苷的應用20-21
• 1.1.4.1 化妝品20-21
• 1.1.4.2 其他用途21
• 1.2 熊果苷的制備方法概述21-27
• 1.2.1 熊果苷的傳統(tǒng)制備方法21-23
• 1.2.1.1 天然產物提取法21-22
• 1.2.1.2 植物組織培養(yǎng)法22-23
• 1.2.1.3 有機合成法23
• 1.2.2 熊果苷的高效制備方法23-27
• 1.2.2.1 酶轉化法24-26
• 1.2.2.2 全細胞轉化法26-27
• 1.3 選題的目的及意義27-28
• 第二章 淀粉蔗糖酶的表達、純化及活性測定28-51
• 2.1 材料和方法28-44
• 2.1.1 試劑、儀器和菌種28-30
• 2.1.2 菌株的培養(yǎng)及分子克隆方法30-38
• 2.1.2.1 培養(yǎng)基的配制30
• 2.1.2.2 標準溶液的配制30-33
• 2.1.2.3 瓊脂糖凝膠的配制33
• 2.1.2.4 SDS-PAGE的配制和電泳檢測33-34
• 2.1.2.5 大腸桿菌的培養(yǎng)34-35
• 2.1.2.6 PCR擴增及其產物回收35
• 2.1.2.7 雙酶切及瓊脂糖凝膠回收35-36
• 2.1.2.8 連接36
• 2.1.2.9 轉化36-37
• 2.1.2.10 陽性克隆鑒定37-38
• 2.1.3 淀粉蔗糖酶的構建和表達38-41
• 2.1.3.1 DrAS-pet28a-rosetta的構建與表達38-40
• 2.1.3.2 DrAS-pYB1s-BW25113的構建與表達40-41
• 2.1.4 淀粉蔗糖酶的純化41-43
• 2.1.4.1 目的蛋白的純化41-42
• 2.1.4.2 目的蛋白的保存42
• 2.1.4.3 目的蛋白的濃度測定42-43
• 2.1.5 淀粉蔗糖酶的酶活測定43-44
• 2.1.5.1 二硝基水楊酸(DNS)的配制44
• 2.1.5.2 果糖標準曲線的繪制44
• 2.1.5.3 淀粉蔗糖酶酶活的測定44
• 2.1.5.4 淀粉蔗糖酶酶活的計算44
• 2.2 結果與分析44-49
• 2.2.1 淀粉蔗糖酶的表達44-48
• 2.2.1.1 DrAS-pet28a-rosetta的表達44-47
• 2.2.1.2 DrAS-pYB1s-BW25113的表達47-48
• 2.2.2 淀粉蔗糖酶的純化48
• 2.2.3 淀粉蔗糖酶的酶活測定48-49
• 2.3 本章小結49-51
• 第三章 全細胞催化法生產α-熊果苷以及轉化條件的優(yōu)化51-63
• 3.1 材料與方法51-54
• 3.1.1 材料51
• 3.1.2 比較兩株基因工程菌催化生產α熊果苷的能力大小51
• 3.1.3 優(yōu)化全細胞催化法合成α熊果苷的轉化條件51-54
• 3.1.3.1 Vc濃度52
• 3.1.3.2 蔗糖濃度52
• 3.1.3.3 轉化溫度52
• 3.1.3.4 轉化時間52-53
• 3.1.3.5 對苯二酚濃度53
• 3.1.3.6 細胞濃度53
• 3.1.3.7 不同溫度下表達的菌體53
• 3.1.3.8 二次轉化53-54
• 3.1.3.9 凍存細胞轉化54
• 3.1.4 α-熊果苷的檢測54
• 3.1.4.1 HPLC法54
• 3.1.4.2 TLC法54
• 3.2 結果與討論54-62
• 3.2.1 α-熊果苷和對苯二酚標準曲線的繪制54-55
• 3.2.2 兩株基因工程菌催化生產α-熊果苷的能力大小比較55
• 3.2.3 全細胞催化法合成α-熊果苷轉化條件的優(yōu)化結果55-62
• 3.2.3.1 不同濃度Vc對α-熊果苷產量的影響55-56
• 3.2.3.2 蔗糖濃度對反應轉化率的影響56-57
• 3.2.3.3 轉化溫度對反應轉化率的影響57
• 3.2.3.4 反應時間對反應轉化率的影響57-59
• 3.2.3.5 對苯二酚濃度對α-熊果苷產量的影響59-60
• 3.2.3.6 不同細胞濃度對反應轉化率的影響60
• 3.2.3.7 不同溫度下表達的酶對反應轉化率的影響60-61
• 3.2.3.8 二次轉化對反應轉化率的影響61
• 3.2.3.9 用凍存細胞轉化對反應轉化率的影響61-62
• 3.3 本章小結62-63
• 第四章 α-熊果苷的分離純化和結構鑒定63-72
• 4.1 α-熊果苷的分離純化63-69
• 4.1.1 材料與儀器設備63
• 4.1.2 分離純化方法63-65
• 4.1.2.1 大孔吸附樹脂柱層析的操作63-64
• 4.1.2.2 硅膠柱層析的操作64-65
• 4.1.3 結果與討論65-69
• 4.1.3.1 大孔吸附樹脂H107進行一步純化65-67
• 4.1.3.2 硅膠柱進行二步純化67-69
• 4.2 核磁共振鑒定化學結構69-70
• 4.2.1 儀器及試劑69
• 4.2.2 NMR譜解析69-70
• 4.2.2.1 化學位移歸屬69-70
• 4.2.2.2 數據解析70
• 4.3 本章小結70-72
• 總結與創(chuàng)新點72-73
• 參考文獻73-77
• 致謝77-79
• 在讀期間參與發(fā)表文章79-80
• 學化論文評閱及答辯情況表80

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