本文關(guān)鍵詞：天山根瘤菌MsiR蛋白調(diào)控機理的研究

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【摘要】：中慢生型天山根瘤菌能夠在甘草的根部共生結(jié)瘤固氮,提供植物生長所需的氮源。這種共生關(guān)系的建立依賴于根瘤菌與宿主植物之間復雜的信息交流。在甘草萌發(fā)初期,其分泌的抗菌物質(zhì)刀豆氨酸能夠殺死植株周圍可能的有害細菌,而在天山根瘤菌中存在著刀豆氨酸的外運系統(tǒng)MsiAR系統(tǒng),使其在甘草根際選擇性的環(huán)境下繼續(xù)繁殖,成為優(yōu)勢菌群,為后來的結(jié)瘤共生提供有力條件。MsiR蛋白,屬于LysR轉(zhuǎn)錄調(diào)控家族成員,能夠啟動msiA基因的表達,刀豆氨酸作為輔助誘導物。LysR型轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白是原核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白中最大的一類家族蛋白,參與調(diào)控的基因類型多種多樣,包括毒力、代謝、群體感應和游動性等多種功能基因。本文以MsiR為主要研究對象,探究MsiR對msiA基因表達的調(diào)控機制,豐富對LysR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的認識,實現(xiàn)工業(yè)應用的價值。為研究MsiR對msiA的調(diào)控機制,將MsiR在大腸桿菌中進行重組表達及純化。通過EMSA實驗證實MsiR蛋白與啟動子DNA的結(jié)合,加入刀豆氨酸能增強這種結(jié)合。與此同時,通過等溫量熱滴定確定了刀豆氨酸與MsiR之間存在相互作用,刀豆氨酸與MsiR結(jié)合的化學計量數(shù)為1,Kd值為1.86μM。通過5'race實驗確定了 msiA基因的轉(zhuǎn)錄起始位點,并由此推測了-10區(qū)和-35區(qū)。采用啟動子長度步移及定點突變確定了影響MsiR轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的5個重要位點：RBS-1 (-70,-67)、RBS-2 (-59,-56)、ABS-1 (-50,-47)、ABS-2 (-41,-37)、 ABS-3 (-30,-27),并由此預測了MsiR蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模型：無刀豆氨酸存在的情況下,MsiR以四聚體形式存在,并呈現(xiàn)出開放型的構(gòu)象,其結(jié)合到msiA調(diào)控區(qū)的RBS-1、RBS-2、ABS-2、ABS-3位點。此時,DNA的彎曲角度較緩,MsiR遮住了msiA啟動子的-35區(qū),使RNA聚合酶與啟動子DNA結(jié)合效率大大降低,基因的表達水平處于極低的狀態(tài)。在加入了刀豆氨酸以后MsiR仍以四聚體形式存在,但轉(zhuǎn)變成為緊縮型的構(gòu)象結(jié)合到msiA調(diào)控區(qū)的RBS-1、RBS-2、ABS-2位點,此時,DNA的彎曲角度變大,被遮蓋的msiA啟動子的-35區(qū)暴露出來,RNA聚合酶與啟動子DNA的結(jié)合效率有了明顯的提高,基因的表達水平處于較高的狀態(tài)。最后,本研究構(gòu)建了MsiR突變文庫,進行了喪失轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性突變株和37℃誘導高可溶性突變株的篩選,得到了影響MsiR生理特性的重要位點,具有十分重要的理論價值。
【關(guān)鍵詞】：天山根瘤菌 MsiR 轉(zhuǎn)錄調(diào)控 突變體文庫篩選
【學位授予單位】：天津科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q78;Q939.114
【目錄】：

• 摘要4-5
• abstract5-9
• 1 前言9-20
• 1.1 中慢生型天山根瘤菌概述9
• 1.2 MsiR的生理功能9-10
• 1.3 LysR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白10-14
• 1.3.1 LysR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的典型結(jié)構(gòu)10
• 1.3.2 LysR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的調(diào)控模型10-11
• 1.3.3 LysR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的應用前景11-14
• 1.4 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的體外研究策略14-17
• 1.4.1 DNA與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的相互作用與研究14-16
• 1.4.2 小分子配體與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的相互作用與研究16-17
• 1.5 突變文庫的構(gòu)建策略17-18
• 1.5.1 易錯PCR技術(shù)17-18
• 1.5.2 致突變菌株構(gòu)建突變文庫18
• 1.6 本課題研究目的意義及內(nèi)容18-20
• 1.6.1 研究目的和意義18
• 1.6.2 研究內(nèi)容18-20
• 2 材料與方法20-45
• 2.1 實驗材料20-24
• 2.1.1 菌株20-21
• 2.1.2 質(zhì)粒21-22
• 2.1.3 試劑22-23
• 2.1.4 酶與試劑盒23
• 2.1.5 實驗儀器23-24
• 2.1.6 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件24
• 2.1.7 抗生素及其他常用試劑24
• 2.2 常用實驗方法24-31
• 2.2.1 質(zhì)粒抽提24-25
• 2.2.2 基因組的提取25
• 2.2.3 核酸回收25-27
• 2.2.4 轉(zhuǎn)化與接合27-28
• 2.2.5 電泳28-29
• 2.2.6 酶反應體系29-30
• 2.2.7 信號檢測30-31
• 2.3 MsiR生理活性的初步研究31-34
• 2.3.1 MsiR蛋白表達及純化31-33
• 2.3.2 MsiR蛋白的生物活性33-34
• 2.4 MsiR蛋白的重要的調(diào)控位點34-41
• 2.4.1 引物序列34-37
• 2.4.2 MsiR結(jié)合DNA引起DNA彎曲角度的改變37
• 2.4.3 msiA基因的轉(zhuǎn)錄起始位點的確定37-38
• 2.4.4 msiA基因的啟動子步移實驗38-41
• 2.5 MsiR蛋白突變體的篩選41-45
• 2.5.1 喪失轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的MsiR蛋白突變體篩選41-43
• 2.5.2 37℃高可溶性的MsiR蛋白突變體篩選43-45
• 3 結(jié)果與討論45-67
• 3.1 MsiR蛋白的生物活性45-52
• 3.1.1 組氨酸對MsiR蛋白的生理活性的影響45-46
• 3.1.2 MsiR蛋白表達載體的構(gòu)建及MsiR蛋白的純化46-47
• 3.1.3 MsiR與啟動子區(qū)DNA的相互作用驗證47-49
• 3.1.4 MsiR的寡聚化形態(tài)分析49-51
• 3.1.5 MsiR與小分子配體的相互作用的熱力學參數(shù)51-52
• 3.2 MsiR蛋白的重要的調(diào)控位點52-58
• 3.2.1 MsiR結(jié)合DNA引起DNA彎曲角度的改變52-53
• 3.2.2 msiA基因的轉(zhuǎn)錄起始位點的確定53-54
• 3.2.3 msiA啟動子區(qū)域的正向步移54-55
• 3.2.4 msiA啟動子區(qū)域的反向步移55
• 3.2.5 MsiR蛋白與啟動子DNA結(jié)合位點的確定55-57
• 3.2.6 MsiR蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模型57-58
• 3.3 MsiR蛋白突變株的篩選58-67
• 3.3.1 突變文庫的質(zhì)量評價58-59
• 3.3.2 突變文庫篩選的可行性分析及篩選條件59-61
• 3.3.3 不同類型的MsiR蛋白突變株61-67
• 4 結(jié)論67-68
• 5 展望68-69
• 6 參考文獻69-76
• 7 攻讀碩士學位期間發(fā)表論文情況76-77
• 8 致謝77

【相似文獻】

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 馬騰;天山根瘤菌MsiR蛋白調(diào)控機理的研究[D];天津科技大學;2015年

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本文編號：1069366