多年來(lái)農(nóng)田土壤重金屬污染是我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)的主要威脅，因此研究生物修復(fù)農(nóng)業(yè)土壤關(guān)鍵技術(shù)具有重要意義。木霉菌是廣泛分布于植物根圍的有益微生物，除具有防治土傳植物病害的作用外，還發(fā)現(xiàn)可與植物形成共生體（symbiont）聯(lián)合修復(fù)農(nóng)化物質(zhì)對(duì)環(huán)境的污染，具有修復(fù)土壤重金屬污染的潛在價(jià)值。因此揭示木霉菌耐受重金屬和與修復(fù)性植物互作的機(jī)理是構(gòu)建木霉菌-植物聯(lián)合修復(fù)農(nóng)業(yè)土壤環(huán)境的技術(shù)基礎(chǔ)。本研究是通過(guò)限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)整合（Restriction enzyme mediated integration,REMI）技術(shù)構(gòu)建并篩選獲得耐受Cd的木霉菌突變株，研究突變株耐受Cd及其對(duì)甘藍(lán)型油菜富集Cd的影響，主要結(jié)果如下：以康氏木霉（Trichoderma koningii）T30為出發(fā)菌，利用REMI技術(shù)檢構(gòu)建了200株突變株，篩選獲得10株耐受Cd突變株，與野生株（T30）相比，突變株平均耐受Cd的IC50值增加1.5~2倍。去Cd率達(dá)到23~39%，提高3~4倍。其中，突變株P(guān)6是最理想的突變株。REMI誘變技術(shù)提高了木霉菌對(duì)Cd引起的氧化脅迫效應(yīng)的耐性水平。在Cd脅迫下，P6的MDA峰值小于T30... 

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 重金屬鎘污染土壤的生物修復(fù)
        1.1 重金屬鎘對(duì)農(nóng)田的污染
        1.2 植物修復(fù)
        1.3 微生物修復(fù)
        1.4 微生物-植物聯(lián)合修復(fù)
            1.4.1 菌根菌-植物聯(lián)合修復(fù)
            1.4.2 根際細(xì)菌-植物聯(lián)合修復(fù)
            1.4.3 木霉-植物聯(lián)合修復(fù)
        1.5 耐受重金屬 Cd 的微生物獲得
    2 真菌耐受重金屬鎘脅迫的機(jī)理
        2.1 胞外絡(luò)合、沉淀
        2.2 細(xì)胞壁結(jié)合
        2.3 跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)
        2.4 胞內(nèi)脫毒
            2.4.1 隔離
            2.4.2 螯合
        2.5 抗氧化作用
    3 展望
    4 本研究的意義和主要研究?jī)?nèi)容
第二章 木霉菌 REMI 突變株構(gòu)建與耐受 Cd 突變株篩選
    1 材料與方法
        1.1 原生質(zhì)體制備
        1.2 轉(zhuǎn)化
        1.3 分子檢測(cè)
        1.4 突變株篩選
            1.4.1 初篩
            1.4.2 復(fù)篩
    2 結(jié)果與分析
        2.1 REMI 突變株構(gòu)建
        2.2 突變株初篩
        2.3 復(fù)篩
    3 結(jié)論與討論
第三章 木霉菌 REMI 突變株耐受 Cd 的生理生化分析
    1 材料與方法
        1.1 Cd 對(duì) P6 菌絲脅迫的氧化反應(yīng)測(cè)定
            1.1.1 粗酶提取液制備
            1.1.2 MDA 檢測(cè)
            1.1.3 O_2~-檢測(cè)
            1.1.4 GSH 測(cè)定
            1.1.5 CAT 活性的測(cè)定
            1.1.6 SOD 活性的測(cè)定
        1.2 富集 Cd 亞細(xì)胞定位及吸附基團(tuán)鑒定
            1.2.1 Cd 亞細(xì)胞定位的超微觀察
            1.2.2 細(xì)胞吸附 Cd 的生化基團(tuán)鑒定
        1.3 影響吸附 Cd~(2+)的因素分析
        1.4 統(tǒng)計(jì)分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 Cd 對(duì)木霉菌的氧化脅迫作用
        2.2 抗氧化脅迫作用
        2.3 富集 Cd 亞細(xì)胞定位及吸附基團(tuán)鑒定
            2.3.1 突變株富集 Cd 亞細(xì)胞定位
            2.3.2 細(xì)胞壁吸附 Cd 的相關(guān)基團(tuán)
        2.4 吸附動(dòng)力學(xué)
        2.5 影響突變株吸附 Cd 的因素分析
    3 結(jié)論與討論
        3.1 突變株 P6 具有較強(qiáng)耐受 Cd 所致氧化脅迫能力
        3.2 明確了突變株 P6 菌絲吸附 Cd 位點(diǎn)
        3.3 環(huán)境 pH 是影響 P6 吸附 Cd 效率的關(guān)鍵因子
第四章 REMI 突變株插入位點(diǎn)側(cè)翼基因克隆與序列分析
    1 材料與方法
        1.1 質(zhì)粒搶救
        1.2 tkpah 基因克隆
        1.3 生物信息學(xué)分析
        1.4 tkpah 表達(dá)特征
        1.5 tkpah 的 GFP 標(biāo)記定位
        1.6 tkpah 基因拷貝數(shù)分析
        1.7 Tkpah 原核表達(dá)、純化和酶活檢測(cè)
    2 結(jié)果與分析
        2.1 質(zhì)粒搶救
        2.2 tkpah 基因克隆
        2.3 tkpah 推斷氨基酸序列分析
        2.4 tkpah 系統(tǒng)進(jìn)化樹
        2.5 Tkpah 蛋白原核表達(dá)和純化
        2.6 酶活檢測(cè)
        2.7 tpah 基因表達(dá)分析
        2.8 tkpah 的 GFP 定位
    3 結(jié)論與討論
        3.1 成功構(gòu)建了木霉菌 REMI 突變株質(zhì)粒搶救技術(shù)體系
        3.2 tkpah 是細(xì)胞質(zhì) GVIIPLA2基因同源物
        3.3 tkpah 表達(dá)具有組織特異性
第五章 tkpah 基因功能分析
    1 材料與方法
        1.2 tkpah 的構(gòu)建
            1.2.1 敲除載體構(gòu)建
            1.2.2 轉(zhuǎn)化、篩選和驗(yàn)證
            1.2.3 敲除子菌落形態(tài)、生長(zhǎng)分析
            1.2.4 敲除子重金屬 Cd 和 H_2O_2的耐受力檢測(cè)
            1.2.5 敲除子對(duì)重金屬 Cd 的吸附
    2 結(jié)果
        2.1 tkpah 構(gòu)建
        2.2 敲除子菌落形態(tài)和生長(zhǎng)分析
        2.3 敲除子對(duì) Cd 和 H2O2脅迫的耐受性分析
        2.4 敲除子吸附 Cd 的特性
    3 結(jié)論與討論
        3.1 tkpah 可能以負(fù)調(diào)控方式控制木霉菌對(duì) Cd 的耐受性
        3.2 木霉菌存在多重吸附 Cd 的機(jī)理
第六章 REMI 突變株應(yīng)答 Cd 脅迫蛋白質(zhì)組分析
    1 材料與方法
        1.1 Cd 處理的 P6 菌絲蛋白樣品制備
        1.2 雙向電泳
            1.2.1 水化
            1.2.2 等電聚焦
            1.2.3 平衡
            1.2.4 二向電泳
        1.3 圖像采集、質(zhì)譜鑒定
    2 結(jié)果與分析
        2.1 Cd 脅迫下的 P6 菌絲體蛋白質(zhì)組變化
        2.2 差異蛋白質(zhì)譜鑒定
    3 結(jié)論與討論
        3.1 雙向電泳是研究木霉菌耐 Cd 脅迫機(jī)理的有效手段
        3.2 Cd 脅迫可明顯影響木霉 REMI 突變株抗逆相關(guān)蛋白表達(dá)
第七章 REMI 突變株對(duì)油菜富集 Cd 的影響
    1 材料與方法
        1.1 土壤處理
        1.2 盆栽試驗(yàn)
        1.3 油菜生物量測(cè)定
        1.4 油菜組織內(nèi)的 Cd 濃度測(cè)定
        1.5 數(shù)據(jù)分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 P6 對(duì)油菜生長(zhǎng)和耐 Cd 的影響
        2.2 P6 促進(jìn)油菜地上部組織富集 Cd
        2.3 P6 增加了油菜對(duì)土壤 Cd 污染的凈化率
    3 結(jié)論與討論
        3.1 木霉菌突變株提高了油菜富集 Cd 的能力
        3.2 土壤 Cd 濃度影響油菜對(duì) Cd 的吸附效果
第八章 全文總結(jié)和后續(xù)研究展望
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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本文編號(hào)：3653539