利用酯酶作為有機(jī)磷農(nóng)藥的生物檢測(cè)劑,在環(huán)保和食品安全等方面有著重要的作用,其檢測(cè)方便,靈敏度高等特點(diǎn)為其廣泛應(yīng)用于有機(jī)磷化合物（OPs）殘留物的檢測(cè),提供了重要的依據(jù)。用乙酰膽堿酯酶（AChE）檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥,己不單單只停留在實(shí)驗(yàn)階段,市場(chǎng)上已有許多利用AChE而開(kāi)發(fā)的農(nóng)藥檢測(cè)試劑盒,但哺乳動(dòng)物來(lái)源的AChE穩(wěn)定性較差,限制了其應(yīng)用,所以開(kāi)發(fā)新型的生物檢測(cè)劑成為了生物工程領(lǐng)域和工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本文以具有高度熱穩(wěn)定性的嗜熱酯酶作為研究對(duì)象,對(duì)其與OPs反應(yīng)的抑制反應(yīng)機(jī)理等進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。我們以來(lái)源于嗜熱菌Archaeoglobus fulgidus的嗜熱酯酶AFEST作為研究對(duì)象,測(cè)定了其與7種結(jié)構(gòu)不同的OPs的抑制反應(yīng)。通過(guò)與農(nóng)藥檢測(cè)試劑盒中的AChE的比較,證實(shí)了AFEST對(duì)有機(jī)磷化合物具有一定的敏感度,但廣譜性較低。隨后我們通過(guò)對(duì)AFEST結(jié)構(gòu)的分析,選擇突變位點(diǎn),成功的構(gòu)建了雙點(diǎn)突變體N44S/S48V。突變體N44S/S48V對(duì)7種OPs的敏感度均有所提高,而且對(duì)其中4種的敏感度已經(jīng)超越了AChE。突變體拓寬了AFEST能敏感反應(yīng)的OPs的種類(lèi),為AFEST能成功取代... 

【文章來(lái)源】：吉林大學(xué)吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：112 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 有機(jī)磷化合物簡(jiǎn)介
        1.1.1 有機(jī)磷化合物的種類(lèi)
        1.1.2 農(nóng)藥檢測(cè)技術(shù)
    1.2 生物感受器
        1.2.1 乙酰膽堿酯酶
        1.2.2 其他生物感受器
    1.3 酶與抑制劑相互作用的研究方法
        1.3.1 抑制類(lèi)型的簡(jiǎn)介
        1.3.2 抑制動(dòng)力學(xué)
        1.3.3 半抑制濃度(IC_(50))
    1.4 固定化
    1.5 嗜熱羧酸酯酶簡(jiǎn)介
    1.6 立題依據(jù)
    1.7 參考文獻(xiàn)
第二章 嗜熱酯酶AFEST與有機(jī)磷化合物反應(yīng)的研究
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.1 菌種
        2.2.2 試劑
        2.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.2.4 溶液配制
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 嗜熱酯酶AFEST的制備
        2.3.2 嗜熱酯酶AFEST的鎳親和柱純化
        2.3.3 酯酶活力的測(cè)定
        2.3.4 動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定
        2.3.5 抑制反應(yīng)時(shí)間的確定
        2.3.6 抑制動(dòng)力學(xué)的研究
        2.3.7 半抑制濃度的測(cè)定
        2.3.8 穩(wěn)定性研究
    2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
        2.4.1 嗜熱酯酶AFEST的制備
        2.4.2 孵育時(shí)間的確定
        2.4.3 抑制動(dòng)力學(xué)的研究
        2.4.4 半抑制濃度的研究
        2.4.5 穩(wěn)定性研究
    2.5 小結(jié)
    2.6 參考文獻(xiàn)
第三章 嗜熱酯酶AFEST的半理性設(shè)計(jì)
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.2 同源序列比對(duì),蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)及蛋白質(zhì)底物口袋大小的測(cè)定
        3.2.3 突變體的構(gòu)建
        3.2.4 突變體的純化
        3.2.5 突變體活力的測(cè)定
        3.2.6 突變體動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定
        3.2.7 突變體IC_(50)的測(cè)定
        3.2.8 雙點(diǎn)突變體N44S/S48V抑制動(dòng)力學(xué)的測(cè)定
        3.2.9 突變體穩(wěn)定性的測(cè)定
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 突變位點(diǎn)的確定
        3.3.2 突變體的篩選
        3.3.3 新突變位點(diǎn)的確定
        3.3.4 突變體純化及動(dòng)力學(xué)結(jié)果
        3.3.5 IC_(50)數(shù)據(jù)分析
        3.3.6 抑制動(dòng)力學(xué)的研究
        3.3.7 突變體穩(wěn)定性的研究
        3.3.8 突變體模型的建立
        3.3.9 對(duì)接模型的研究
    3.4 小結(jié)
    3.5 參考文獻(xiàn)
第四章 酶固定化
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.1 試劑
        4.2.2 儀器
        4.2.3 溶液配制
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 固定化條件的摸索
        4.3.2 固定化酶活力的測(cè)定
        4.3.3 固定化酶穩(wěn)定性的測(cè)定
        4.3.4 固定化酶對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)
    4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論
        4.4.1 固定化條件的確定
        4.4.2 固定化酶活力及固定化效率的測(cè)定
        4.4.3 固定化酶對(duì)有機(jī)磷化合物的檢測(cè)
        4.4.4 固定化酶穩(wěn)定性的研究
    4.5 小結(jié)
    4.6 參考文獻(xiàn)
創(chuàng)新點(diǎn)
展望
作者簡(jiǎn)歷
參與的科研課題
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]戊二醛交聯(lián)殼聚糖固定化青霉素G�；讣捌湫再|(zhì)研究[J]. 程仕偉,賈彥榮,繆靜,屈慧鴿.  煙臺(tái)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)與工程版). 2011(02)
[2]有機(jī)磷及氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留檢測(cè)研究進(jìn)展[J]. 萬(wàn)圣,呂延成.  廣東農(nóng)業(yè)科學(xué). 2009(03)
[3]大分子擁擠下介孔中木瓜蛋白酶的微波輔助固定化[J]. 劉明慶,王安明,王華,周成,杜志強(qiáng),祝社民,楊明,張俊,沈樹(shù)寶.  過(guò)程工程學(xué)報(bào). 2009(01)
[4]緩沖QuEChERS法提取氣相色譜火焰光度檢測(cè)法快速測(cè)定水果蔬菜中39種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留[J]. 張秀堯,蔡欣欣,陳珞洛,鄭三燕.  中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志. 2007(12)
[5]氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定茶葉中42種殘留農(nóng)藥[J]. 董金斌,王金花,盧曉宇,徐超一,楊俊佼.  北京化工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2007(05)
[6]毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定蔬菜中殘留硫線磷[J]. 應(yīng)興華,徐霞,陳能,朱智偉.  理化檢驗(yàn)(化學(xué)分冊(cè)). 2006(03)
[7]固定化對(duì)動(dòng)植物酯酶性質(zhì)的影響[J]. 許學(xué)勤,徐斐,吳燕雯,吳瑛,華澤釗.  食品與發(fā)酵工業(yè). 2004(07)
[8]食品中農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)方法的研究[J]. 劉慧,閆樹(shù)剛,朱力.  中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào). 2003(04)
[9]固定化酶的制備及應(yīng)用[J]. 李彥鋒,李軍榮,伏蓮娣.  高分子通報(bào). 2001(02)
[10]酶的固定化技術(shù)及其應(yīng)用[J]. 張偉,楊秀山.  自然雜志. 2000(05)



本文編號(hào)：3428102