尼古丁是一種天然的生物堿,進入人體后能對多種組織如心、腦、肺和血管等造成損傷,容易引發(fā)肺癌在內的多種疾病。我國是煙草生產和消費的大國,煙草加工過程中所產生的廢棄物中含有較高濃度的尼古丁,給環(huán)境帶來極大威脅。微生物處理該類型的污染是一種高效、可靠和無二次污染的綠色處理方式。因此,篩選高效降解尼古丁的微生物菌種資源,探索其降解機制機理,充分發(fā)揮其降解能力,具有重要的理論意義和應用價值。本研究的意義在于分離、篩選高效尼古丁降解菌株,并對菌株在不同環(huán)境條件下降解尼古丁的特性進行研究,測定降解途徑,克隆關鍵降解酶基因,從生物化學和分子生物學角度揭示Pseudomonas sp. HZN6降解尼古丁的新機制,為尼古丁引起的環(huán)境污染的微生物降解修復及綠色轉化提供理論和技術依據(jù)。本研究從從杭州農藥廠的活性污泥中分離到1株尼古丁高效降解菌株HNZ6,可以利用尼古丁為唯一碳源、氮源和能源生長。根據(jù)生理生化特征以及16S rRNA （GenBank登錄號為HQ108345）系統(tǒng)發(fā)育分析,確定菌株HZN6為假單胞菌屬（Pseudomonas）細菌。研究了不同條件對HZN6降解尼古丁的影響,結果顯示降解尼古丁的... 

【文章來源】：浙江大學浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：180 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
目錄
摘要
ABSTRACT
1 緒論
    1.1 尼古丁及其理化性質
    1.2 尼古丁對環(huán)境的污染及生物毒性
        1.2.1 不同來源的尼古丁對環(huán)境的污染
        1.2.2 尼古丁的生物毒性
    1.3 微生物降解尼古丁的機制研究進展
        1.3.1 降解尼古丁的微生物種類
        1.3.2 尼古丁的微生物代謝途徑及分子機制
    1.4 微生物降解尼古丁的應用研究
    1.5 本研究的目的、意義和主要內容
        1.5.1 研究的目的和意義
        1.5.2 研究的主要內容
2 尼古丁降解菌Pseudomonas sp.HZN6的分離、鑒定、降解特性及降解途徑的研究
    2.1 引言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 菌株、試劑與培養(yǎng)基
        2.2.2 降解菌株的富集與分離
        2.2.3 降解菌株的培養(yǎng)特征及生理生化鑒定
        2.2.4 菌體基因組DNA的提取
        2.2.5 菌株16S rRNA基因的PCR擴增
        2.2.6 16S rRNA基因PCR產物的T/A克隆
        2.2.7 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備與酶連產物的轉化
        2.2.8 質粒DNA的小量提取
        2.2.9 16S rRNA基因序列測定和系統(tǒng)發(fā)育地位的確定
        2.2.10 菌體生長量的測定及降解種子液的制備
        2.2.11 尼古丁及中間產物檢測方法
    2.3 結果與討論
        2.3.1 尼古丁降解菌株的分離與篩選
        2.3.2 降解菌株的菌落形態(tài)及生理生化特征
        2.3.3 降解菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位研究
        2.3.4 環(huán)境條件對菌株HZN6降解尼古丁的影響
        2.3.5 尼古丁的代謝產物鑒定和代謝途徑分析
    2.4 小結
3 轉座子隨機突變文庫構建與篩選
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 菌株和質粒
        3.2.2 試劑與培養(yǎng)基
        3.2.3 菌株的培養(yǎng)條件
        3.2.4 轉座子誘變
        3.2.5 尼古丁降解失活突變株的篩選
        3.2.6 尼古丁降解失活突變株的驗證
        3.2.7 尼古丁及其中間產物的檢測方法
    3.3 結果與討論
        3.3.1 轉座子誘變最優(yōu)條件的選擇
        3.3.2 轉座突變的效率
        3.3.3 幾株代表性突變株的表型分析
    3.4 小結
4 3-琥珀酰吡啶降解相關基因sirA2的克隆和功能鑒定
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 試劑與培養(yǎng)基
        4.2.2 菌株、質粒與培養(yǎng)條件
        4.2.3 分子生物學操作方法
        4.2.4 轉座子插入突變基因的SEFA-PCR克隆
        4.2.5 克隆序列的測定、組裝與分析
        4.2.6 sirA2基因的敲除
        4.2.7 sirA2基因的功能互補
        4.2.8 重組菌株降解尼古丁、SP和次黃嘌呤的特性分析
        4.2.9 尼古丁、SP和次黃嘌呤的檢測方法
    4.3 結果與分析
        4.3.1 突變株N6ml的篩選與表型分析
        4.3.2 SEFA-PCR克隆突變基因
        4.3.3 克隆基因的測序、組裝與分析
        4.3.4 sirA2基因的敲除與功能互補
        4.3.5 鎢對SP和次黃嘌呤降解的影響
    4.4 討論
        4.4.1 sirA基因的來源與功能
        4.4.2 硫轉移酶與羥化酶的相互關系
    4.5 小結
5 假氧尼古丁氧化酶和3-琥珀酰半醛吡啶脫氫酶的克隆、表達和酶學特性研究
    5.1 引言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 試劑與培養(yǎng)基
        5.2.2 菌株、質粒與培養(yǎng)條件
        5.2.3 分子生物學操作方法
        5.2.4 突變株N6mC8突變基因的SEFA-PCR克隆
        5.2.5 克隆序列的測定、組裝與分析
        5.2.6 假氧尼古丁氧化酶和3-琥珀酰半醛吡啶脫氫酶的異源表達和純化
        5.2.7 尼古丁及代謝產物的檢測方法
        5.2.8 酶的功能鑒定、動力學參數(shù)測定及酶學特性分析
        5.2.9 pao和sap基因的敲除
        5.2.10 pao基因的功能互補
        5.2.11 重組菌株降解特性分析
    5.3 結果與分析
        5.3.1 突變株N6mC8的篩選與表型分析
        5.3.2 SEFA-PCR克隆突變基因
        5.3.3 克隆基因的測序、組裝與分析
        5.3.4 PNAO和SAPD的基因克隆、異源表達與純化
        5.3.5 PNAO的輔酶FAD
        5.3.6 PNAO的功能鑒定
        5.3.7 PNAO的酶學特性與動力學參數(shù)
        5.3.8 SAPD的功能鑒定
        5.3.9 pao和sap基因的敲除與功能互補
        5.3.10 重組菌株的降解特性分析
    5.4 討論
        5.4.1 pao和sap基因為新基因
        5.4.2 PNAO酶的特性
    5.5 小結
6 尼古丁氧化酶基因的克隆和功能鑒定
    6.1 引言
    6.2 材料與方法
        6.2.1 試劑與培養(yǎng)基
        6.2.2 菌株、質粒與培養(yǎng)條件
        6.2.3 常規(guī)分子生物學操作方法
        6.2.4 pao基因上游基因序列的SEFA-PCR克隆
        6.2.5 克隆序列的測定、組裝與分析
        6.2.6 尼古丁氧化酶NOX的基因克隆、異源表達與純化
        6.2.7 nox基因的敲除
        6.2.8 nox基因的功能互補
        6.2.9 RNA的提取與RT-PCR
        6.2.10 NOX蛋白三維結構的預測與分子對接
        6.2.11 NOX蛋白的定點突變
        6.2.12 重組菌株降解特性分析
        6.2.13 尼古丁及中間產物的分析方法
    6.3 結果與分析
        6.3.1 SEFA-PCR克隆pao基因上游未知序列
        6.3.2 克隆基因的測序、組裝與分析
        6.3.3 nox基因的體外功能鑒定
        6.3.4 nox基因的轉錄
        6.3.5 nox基因的體內敲除與功能互補
        6.3.6 重組菌株的降解特性
        6.3.7 NOX的無手性選擇性降解尼古丁
        6.3.8 NOX的異源表達與純化
        6.3.9 NOX的同源模建與分子對接
        6.3.10 NOX的定點突變
    6.4 討論
    6.5 小結
7 論文總結
    7.1 研究結論
    7.2 創(chuàng)新點
    7.3 不足與展望
參考文獻
攻讀博士學位期間研究成果與個人榮譽
    研究成果
    個人榮譽
致謝



本文編號：3365327