土壤中超過(guò)90%的微生物以生物膜的形式存在。生物膜可通過(guò)形成的胞外聚合物使其獲得競(jìng)爭(zhēng)性優(yōu)勢(shì),如加強(qiáng)生物膜內(nèi)微生物之間群體感應(yīng)效應(yīng)、幫助細(xì)胞在表面定殖、減少污染物的細(xì)胞毒性等。工業(yè)生產(chǎn)釋放進(jìn)入土壤以及土壤中天然存在的納米顆粒(NPs)由于表面活性強(qiáng),在土壤生物膜的形成、結(jié)構(gòu)調(diào)控和功能發(fā)揮等方面具有重要作用。然而,目前對(duì)土壤中生物膜和NPs間相互作用及其功能的了解還相當(dāng)欠缺,特別是從分子水平上對(duì)這些作用過(guò)程和機(jī)理的認(rèn)識(shí)非常膚淺。因此,本課題選取外源工程N(yùn)Ps氧化鋅(ZnO)和土壤納米礦物赤鐵礦(hematite)與代表性土壤細(xì)菌-惡臭假單胞菌,運(yùn)用化學(xué)方法、微生物及分子生物學(xué)技術(shù)和借助現(xiàn)代儀器分析手段如激光共聚焦顯微鏡(CLSM)、透射電子顯微鏡(TEM)、掃描電子顯微鏡(SEM)、石英晶體微天平(QCM-D)、等溫滴定微量熱儀(ITC)、結(jié)構(gòu)光照明超分辨顯微鏡(SIM)等,分析不同類型NPs與細(xì)菌相互作用的分子機(jī)理,探討NPs對(duì)細(xì)菌生物膜形成、結(jié)構(gòu)和功能的影響,明確生物膜中細(xì)胞對(duì)NPs響應(yīng)的分子機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:(1)闡明了表面結(jié)合態(tài)腐殖酸(HA)介導(dǎo)下的赤鐵礦納米顆粒對(duì)惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的細(xì)胞毒性機(jī)制。純赤鐵礦納米顆粒能夠顯著抑制細(xì)菌的生長(zhǎng),其半致死濃度(24 h-LC_(50))為23.58 mg L~(-1),而表面結(jié)合HA后可以顯著減輕赤鐵礦的毒性,其復(fù)合體的最大LC_(50)達(dá)到4774.23 mg L~(-1),這一結(jié)果也在納米顆粒對(duì)惡臭假單胞菌細(xì)胞活性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中被證實(shí)。共沉淀實(shí)驗(yàn)和透射電子顯微鏡觀察表明,表面結(jié)合態(tài)的HA阻礙了赤鐵礦納米顆粒對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的粘附且限制了其發(fā)生內(nèi)生化作用。與純赤鐵礦納米顆粒相比,赤鐵礦-腐殖酸復(fù)合體體系中胞內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生和氧化應(yīng)激基因的表達(dá)受到顯著抑制。減少粘附作用和抑制ROS的產(chǎn)生可能是HA減輕赤鐵礦納米顆粒毒性的主要原因。本研究還根據(jù)Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek(DLVO)理論模型評(píng)估了赤鐵礦和細(xì)菌細(xì)胞膜之間的界面相互作用能,發(fā)現(xiàn)納米顆粒與細(xì)菌細(xì)胞接觸的機(jī)率越大則其細(xì)胞毒性越強(qiáng),而納米顆粒與細(xì)菌細(xì)胞膜間能壘越大則其對(duì)細(xì)菌的毒性越低。研究結(jié)果為更好地理解自然環(huán)境中細(xì)菌或細(xì)菌生物膜與礦物相互作用提供了有益的借鑒。(2)揭示了細(xì)菌生物膜在形成過(guò)程中對(duì)工程納米顆粒-Zn O NPs的響應(yīng)機(jī)制及納米顆粒的濃度效應(yīng)。在低濃度閾值(0.5-30 mg L~(-1))內(nèi)的ZnO NPs能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和生物膜的形成,而高濃度的ZnO NPs(30 mg L~(-1))顯著抑制生物膜形成。CLSM分析結(jié)果表明,細(xì)菌細(xì)胞能夠在0.5 mg L~(-1)的ZnO NPs表面大量定殖并形成生物膜,而在250 mg L~(-1)的ZnO NPs表面的細(xì)胞定殖和形成的生物膜生物量比純細(xì)菌對(duì)照體系中生物膜生物量低11倍。0.5 mg L~(-1)的ZnO NPs體系中所測(cè)得的生物膜基質(zhì)中蛋白質(zhì)和糖含量的顯著增加進(jìn)一步證實(shí)了ZnO NPs的低濃度刺激效應(yīng)。各處理中細(xì)胞生長(zhǎng)和生物膜形成的顯著差異也在細(xì)胞氧化應(yīng)激以及生物膜形成相關(guān)基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)中得到了驗(yàn)證。0.5 mg L~(-1)的ZnO NPs能夠刺激惡臭假單胞菌群體感應(yīng)基因、脂多糖生物合成基因和抗生素抗性基因的表達(dá);而500 mg L~(-1)的ZnO NPs高濃度暴露誘導(dǎo)產(chǎn)生了基因毒性并使得惡臭假單胞菌的抗氧化基因表達(dá)顯著上調(diào)。(3)考察了納米顆粒(ZnO NPs)對(duì)細(xì)菌生物膜形貌和結(jié)構(gòu)的影響。QCM-D結(jié)果顯示,ZnO NPs暴露使得細(xì)菌生物膜厚度和粘彈性降低,粗糙度增加;且ZnO NPs能夠加速成熟生物膜細(xì)胞發(fā)生解體。納米顆粒作用后生物膜中細(xì)胞表面官能團(tuán)濃度顯著下降,細(xì)胞表面次級(jí)蛋白的結(jié)構(gòu)也發(fā)生一定的變化。惡臭假單胞菌吸附在石英晶體表面后能夠形成穩(wěn)定的三維細(xì)胞集群結(jié)構(gòu),其生物膜內(nèi)細(xì)胞呈緊密有序排列。而ZnO NPs顯著抑制細(xì)胞向第三維度定向擴(kuò)增,NPs表面附著的細(xì)胞分散且排列紊亂,很難形成完整的生物膜。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：X172;X53
【部分圖文】：

的生命形式?jīng)Q定著地球演替的進(jìn)程和方向，推動(dòng)著土壤的形元素循環(huán)轉(zhuǎn)化過(guò)程中的重要驅(qū)動(dòng)者。土壤微生物是連接地球及大氣圈間能量和物質(zhì)交換的重要橋梁，維系著地球自然生境的可持續(xù)性發(fā)展（宋長(zhǎng)青等 2013）。如圖 1-1 所示，微生在土壤礦物顆粒及其與其它物質(zhì)形成的團(tuán)聚體表面（Huang生物組是指所有土壤中存在的微生物以及它們的棲息環(huán)境。功能及其群落結(jié)構(gòu)的協(xié)同演替規(guī)律是研究土壤微生物組的核生、糧食生產(chǎn)和環(huán)境保護(hù)等生活生產(chǎn)中的基礎(chǔ)需求均與土壤關(guān)（賀紀(jì)正等 2009）。開(kāi)展有關(guān)土壤微生物學(xué)的研究對(duì)于揭的產(chǎn)生及其維持機(jī)制，預(yù)測(cè)陸地生態(tài)系統(tǒng)功能的演變趨勢(shì)，知的生物資源至關(guān)重要。

細(xì)菌生物膜對(duì)天然及工程納米顆粒的響應(yīng)機(jī)制1.2.1 生物膜定義及組成生物膜是細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中為適應(yīng)生存環(huán)境而吸附于生物或非生物表面形成的一種與浮游細(xì)胞相對(duì)應(yīng)的生長(zhǎng)方式，由細(xì)菌和自身分泌的胞外基質(zhì)組成（Schembri etal. 2002）。生物膜在自然界中很常見(jiàn)，如在輸水系統(tǒng)、醫(yī)療、食品加工等領(lǐng)域都可見(jiàn)到細(xì)菌生物膜的形成（圖 1-2）。生物膜具有穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)（Danese et al. 2000），其細(xì)菌細(xì)胞被胞外基質(zhì)（生物膜基質(zhì)）所構(gòu)成的一個(gè)具有粘性和強(qiáng)大的框架包裹并保護(hù)著。生物膜基質(zhì)不僅可以協(xié)助生物膜內(nèi)細(xì)胞抵御外界的環(huán)境脅迫、為其存活及生長(zhǎng)提供必需的養(yǎng)分，也可作為增強(qiáng)細(xì)胞代謝活動(dòng)的外部消化系統(tǒng)。有研究指出生物膜內(nèi)細(xì)菌對(duì)外界脅迫的抵御能力比浮游細(xì)菌要高 10-1000 倍，其中的主要原因是因?yàn)樯锬せ|(zhì)能起到一個(gè)物理屏障作用（O'Toole et al. 2000）。

圖 1-3 生物膜形成過(guò)程中細(xì)胞的生命循環(huán)模式圖 （McDougald et al. 2012）Fig. 1-3 Life cycle model of cells during biofilm formation (McDougald et al. 2012).3 納米顆粒的起源、定義及分類.3.1 納米顆粒起源及定義近十年中，“納米”微觀尺度這一新興的研究課題迅速崛起，為科學(xué)技術(shù)的發(fā)
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本文編號(hào)：2894336