江漢平原高砷沉積物具有特殊的地球化學(xué)特征,生活在其中的微生物在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中,形成了一套獨(dú)特的適應(yīng)機(jī)制,目前對(duì)這類微生物種質(zhì)資源報(bào)道較少;同時(shí)相關(guān)微生物的耐砷機(jī)制和氮素代謝功能也知之甚少。為了解決這一問(wèn)題,我們利用富集培養(yǎng)和對(duì)微生物16S rRNA基因隨機(jī)測(cè)序的方法,成功發(fā)現(xiàn)兩株耐高砷微生物新種26-35~T和CB3~T。本課題開展了對(duì)這兩個(gè)微生物新種的多相分類學(xué)研究和功能基因組分析。菌株26-35~T經(jīng)掃描電鏡觀察,細(xì)胞為6-12μm的桿狀,細(xì)菌嚴(yán)格需氧;PCR擴(kuò)增菌株16S rRNA基因,與EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后發(fā)現(xiàn),其與Luteimonas terricola CGMCC 1.8985~T的16S rRNA基因同源性最高,為96.7%,經(jīng)MEGA 7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析,發(fā)現(xiàn)26-35~T與Luteimonas屬細(xì)菌聚成一類。使用氣相色譜技術(shù)分析26-35~T及Luteimonas屬參考菌L.terricola CGMCC 1.8985~T全細(xì)胞脂肪酸,發(fā)現(xiàn)它們主要的細(xì)胞脂肪酸類型為iso-C_(15:0)、iso-C_(16:0)、iso-C_(17:0)、iso-C_(11:0)、iso-C_(11:0) 3-OH和iso-C_(17:1)ω9c,但其含量在兩菌之間有明顯差異;使用高壓液相色譜法鑒定呼吸醌,26-35~T主要含Q-8;標(biāo)準(zhǔn)雙向電泳層析技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),26-35~T與本屬標(biāo)準(zhǔn)菌株主要的極性脂質(zhì)均為二磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰甘油,但26-35~T還含有2種未鑒定氨基脂質(zhì)和1種未鑒定磷脂;利用高效液相色譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn),26-35~T基因組DNA的G+C含量為71.4 mol%。26-35~T與其它參考菌均具有氧化酶、堿性磷酸酶和萘酚-AS-BI磷酸水解酶活性,但是不具有α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶、α-巖藻糖苷酶和尿素酶活性,不能利用檸檬酸三鈉、L-丙氨酸和D-甘露醇生長(zhǎng)。在水解明膠、淀粉、酪氨酸、ONPG和酪蛋白等方面,26-35~T與參考菌株表現(xiàn)出明顯差異。26-35~T可以微弱水解檸檬酸七葉素鐵,不能產(chǎn)生吲哚、H_2S;可以產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶和細(xì)胞色素氧化酶,但是不能產(chǎn)生精氨酸二水解酶、賴氨酸脫羧酶和鳥氨酸脫羧酶。26-35~T可以同化N-乙�；�-葡糖胺、L-阿拉伯糖;可以微弱利用衣康酸、丙二酸鈉、L-組氨酸和2-酮葡萄糖酸鉀生長(zhǎng)。細(xì)菌同時(shí)具有堿性磷酸酶、酯酶(C4)、類脂酯酶(C8)、亮氨酸芳基酰胺酶、胰蛋白酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶和β-葡萄糖苷酶活性,但不具有類脂酶(C14)、纈氨酸芳酰胺酶、胱氨酸芳酰胺酶、α-胰凝乳蛋白酶、β-葡萄糖醛酸酶、α-葡萄糖苷酶和N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性。該菌株對(duì)氯霉素和萬(wàn)古霉素具有抗性,但對(duì)氨芐青霉素和羧芐青霉素敏感。綜合以上特點(diǎn),26-35~T與Luteimonas屬參考菌株在遺傳標(biāo)記、細(xì)胞化學(xué)組成以及生理生化活性等方面,既有相似性又有一定程度的差異,將26-35~T歸類為L(zhǎng)uteimonas屬的一個(gè)新種,將其命名為L(zhǎng)uteimonas arsenica,模式株為26-35~T(=CCTCC AB 2014326~T=KCTC 42824~T)。菌株CB3~T經(jīng)透射電鏡觀察,細(xì)胞為約1-2μm的球或桿狀,16S rRNA基因序列與Pseudaminobacter屬Pseudaminobacter defluvii THI 051~T同源性最高,為97.8%,系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析顯示CB3~T與Pseudaminobacter屬聚為一類。CB3~T的16S rRNA基因與兩株屬內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān).defluvii THI 051~T和P.salicylatoxidans BN12~T同源性超過(guò)97%,進(jìn)行進(jìn)一步基因組DNA-DNA雜交分析后,表明CB3~T與兩株標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA-DNA雜交值均小于70%,證實(shí)了CB3~T作為Pseudaminobacter屬內(nèi)一個(gè)新的微生物種的分類學(xué)地位;經(jīng)過(guò)氣相色譜分析,發(fā)現(xiàn)CB3~T菌株與另外3株P(guān)seudaminobacter屬參考菌的主要脂肪酸種類一致,為C_(16:0)、cyclo-C_(19:0)ω8c和summed feature 8(C_(18:1)ω7c and/or C_(18:1)ω6c),但CB3~T含有更高含量的summed feature 8,更低含量的cyclo-C_(19:0)ω8c,并且不含有iso-C_(15:0) 3-OH、C_(19:0)和C_(20:2)ω6,9c;使用高壓液相色譜法鑒定呼吸醌,發(fā)現(xiàn)CB3~T含有的主要醌型為泛醌Q-10;標(biāo)準(zhǔn)雙向電泳層析技術(shù)檢測(cè)CB3~T菌株的極性脂類型發(fā)現(xiàn),主要由磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油、磷脂酰二甲基乙醇胺、磷脂酰單甲基乙醇胺、磷脂酰乙醇胺和二磷脂酰甘油胺組成,與Pseudaminobacter屬其他標(biāo)準(zhǔn)菌株極性脂類型保持一致,但含量有細(xì)微差異。CB3~T基因組的G+C含量為61.4%,也處在Pseudaminobacter屬細(xì)菌G+C含量的范圍內(nèi)。另外CB3~T和Pseudaminobacter屬的參考菌具有許多相似的生理生化特征,如均具有過(guò)氧化氫酶、氧化酶、酪蛋白水解酶、亮氨酸芳酰胺酶、磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、胰蛋白酶活性,不具有脂肪酶(C14)、α-胰凝乳蛋白酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、β-葡萄糖苷酶、N-乙酰-β-葡萄糖胺酶、α-甘露糖苷酶、β-巖藻糖苷酶活性;可利用N-乙酰氨基葡萄糖、乳酸、L-丙氨酸、L-組氨酸、3-羥基丁酸、L-脯氨酸、D-葡萄糖和D-甘露醇生長(zhǎng),不可利用D-蔗糖、衣康酸、亞油酸、丙二酸鈉和蜜二糖生長(zhǎng);吲哚產(chǎn)生試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、Voges-Proskauer試驗(yàn)、明膠和DNA水解試驗(yàn)呈陰性;但是CB3~T也有一些獨(dú)特的代謝途徑,如可以利用糖原但不可以利用丙酸生長(zhǎng)等。綜合以上特點(diǎn),CB3~T與Pseudaminobacter屬參考菌株在遺傳標(biāo)記、細(xì)胞化學(xué)組成以及生理生化活性等方面,具有主要分類指標(biāo)的相似性,但也在一些代謝特點(diǎn)中存在差異,這些特征將CB3~T與密切相關(guān)的同屬物種區(qū)分開來(lái),因此確定CB3~T是Pseudaminobacter屬的一個(gè)新種,命名為Pseudaminobacter arsenicus,模式株為CB3~T(=CCTCC AB2016116~T=KCTC52625~T)。本研究還發(fā)現(xiàn)Pseudaminobacter arsenicus CB3~T在厭氧條件下同時(shí)具有異化還原硝酸根產(chǎn)銨和反硝化產(chǎn)氮?dú)獾哪芰?并且體系中碳氮比越高越有利于反硝化作用,而As(V)則對(duì)這一過(guò)程產(chǎn)生抑制;并通過(guò)進(jìn)一步的功能基因組分析,研究了其耐高砷與硝酸鹽異化還原產(chǎn)銨和反硝化產(chǎn)氮?dú)獾姆肿踊A(chǔ),發(fā)現(xiàn)CB3~T除了具有三個(gè)抗砷操縱子,還使用兩種類型的細(xì)胞內(nèi)砷還原酶,同時(shí)還具有多個(gè)As()排出蛋白,推測(cè)是其產(chǎn)生高砷耐受性的分子機(jī)制。另外發(fā)現(xiàn)其基因組中除了NO還原酶Nor外,含有硝酸鹽還原酶(Nap),亞硝酸鹽還原酶(Nir)以及氧化亞氮還原酶(Nos),基本存在較為完整的反硝化基因系統(tǒng),但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)異化還原為銨的關(guān)鍵基因nrfA與nirB,說(shuō)明細(xì)菌可能使用其它未知的代謝通路進(jìn)行異化硝酸鹽還原為銨反應(yīng),具有這一性質(zhì)的耐高砷細(xì)菌還未見報(bào)道。本研究同時(shí)分析了P.arsenicus CB3~T所在的Phyllobacteriaceae科中180株細(xì)菌的砷代謝相關(guān)基因分布以及砷抗性基因操縱子結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)Phyllobacteriaceae科具有非常特別的砷抗性操縱子結(jié)構(gòu),與其它耐砷細(xì)菌主要使用ArsB作為As()外排蛋白相比,該科細(xì)菌主要使用ACR3、AqpS與ArsK三種外排蛋白解毒。本研究分離得到的P.arsenicus CB3~T與同科細(xì)菌相比,含有較多砷代謝相關(guān)基因,說(shuō)明細(xì)菌砷代謝基因多樣性與分離環(huán)境有密切關(guān)系。本項(xiàng)研究不僅豐富了耐砷細(xì)菌的種質(zhì)資源,同時(shí)有助于深刻理解高砷條件下微生物的耐砷與代謝途徑,并為進(jìn)一步研究其機(jī)制提供了材料。
【學(xué)位單位】：中國(guó)地質(zhì)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：X172;X50
【文章目錄】：
作者簡(jiǎn)歷
摘要
abstract
第一章 耐砷環(huán)境微生物研究概況
    1.1 環(huán)境砷污染及其對(duì)人類健康的危害
    1.2 耐砷微生物催化的砷的地球化學(xué)循環(huán)
        1.2.1 砷的抗性還原
        1.2.2 砷的呼吸性還原
        1.2.3 砷的氧化
        1.2.4 砷的甲基化
        1.2.5 耐砷微生物參與其它地球化學(xué)因子代謝
    1.3 細(xì)菌多相分類學(xué)
        1.3.1 多相分類學(xué)
        1.3.2 耐砷微生物系統(tǒng)進(jìn)化研究
    1.4 微生物砷代謝與硝酸鹽還原關(guān)系研究現(xiàn)狀
    1.5 研究目的與技術(shù)路線
        1.5.1 研究目的
        1.5.2 技術(shù)路線
第二章 兩株耐砷菌的多相分類學(xué)研究
    2.1 前言
    2.2 材料
        2.2.1 樣品與菌株
        2.2.2 培養(yǎng)基
        2.2.3 試劑
        2.2.4 主要儀器
        2.2.5 主要使用軟件
    2.3 方法
        2.3.1 細(xì)菌的分離純化
        2.3.2 細(xì)菌的保藏
        2.3.3 細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察
        2.3.4 細(xì)菌基因型特征分析
        2.3.5 細(xì)菌生理生化特征分析
        2.3.6 細(xì)菌化學(xué)組分分析
    2.4 結(jié)果與分析
T的多相分類學(xué)討論'>        2.4.1 菌株26-35^T的多相分類學(xué)討論
T的多相分類學(xué)討論'>        2.4.2 菌株CB3^T的多相分類學(xué)討論
    2.5 本章結(jié)論
T特殊代謝功能研究'>第三章 耐砷菌Pseudaminobacter arsenicus CB3^T特殊代謝功能研究
    3.1 前言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 主要菌株
        3.2.2 主要試劑與儀器
        3.2.3 細(xì)菌抗砷性研究
        3.2.4 細(xì)菌硝酸鹽還原功能研究
        3.2.5 抗性耐砷菌對(duì)毒砂礦（Arsenopyrite）砷釋放影響
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 細(xì)菌抗砷性研究
        3.3.2 細(xì)菌硝酸鹽還原功能研究
        3.3.3 抗性耐砷菌對(duì)毒砂礦（Arsenopyrite）砷釋放影響
    3.4 本章小結(jié)
T功能基因組研究'>第四章 耐砷菌Pseudaminobacter arsenicus CB3^T功能基因組研究
    4.1 前言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 細(xì)菌菌株
        4.2.2 細(xì)菌基因組提取
        4.2.3 基因組測(cè)序組裝
        4.2.4 基因組功能基因注釋
        4.2.5 基因組功能基因分析
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 全基因組特征
        4.3.2 全基因組注釋
        4.3.3 菌株全基因組圈圖
        4.3.4 抗砷相關(guān)基因分析
        4.3.5 硝酸鹽還原相關(guān)基因分析
    4.4 本章小結(jié)
第五章 Phyllobacteriaceae科內(nèi)細(xì)菌砷相關(guān)基因的多樣性研究
    5.1 前言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 基因組序列提取與功能注釋
        5.2.2 基因組保守蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育分析
        5.2.3 砷相關(guān)基因注釋
        5.2.4 砷相關(guān)基因的熱圖分析
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 Phyllobacteriaceae科細(xì)菌基因組的總結(jié)
        5.3.2 Phyllobacteriaceae科菌基因組中砷相關(guān)基因的總體分布
        5.3.3 Phyllobacteriaceae科細(xì)菌基因組中類ars基因分布與結(jié)構(gòu)
        5.3.4 Phyllobacteriaceae科細(xì)菌基因組中類aio和 arr基因的分布
        5.3.5 棲息地影響砷相關(guān)基因的分布
    5.4 本章小結(jié)
第六章 總結(jié)與展望
論文創(chuàng)新點(diǎn)
致謝
附錄
參考文獻(xiàn)


本文編號(hào)：2881865