壬基酚(Nonylphenols,NPs)是一種環(huán)境毒性物質(zhì)和內(nèi)分泌干擾物,可對雄性生殖系統(tǒng)產(chǎn)生危害。事實上,壬基酚并不是單一的化合物,而是帶有一個苯環(huán)和九碳側(cè)鏈化合物的總稱,因此壬基酚存在多種同分異構(gòu)體。其中,九碳側(cè)鏈位于羥基對位的壬基酚被稱為對壬基酚或者是4-壬基酚,是最常見的壬基酚形式且是研究的重點對象,九碳側(cè)鏈為直鏈的4-NP稱為正-NP(4-n-NP)。壬基酚異構(gòu)體的生物效應(yīng)與其結(jié)構(gòu)具有一定的相關(guān)性,因此有必要研究單個壬基酚的生物活性。環(huán)境內(nèi)分泌干擾物主要通過兩種機制發(fā)揮作用,一是通過激活細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路引起細(xì)胞的增殖或者凋亡;另一個是通過激素受體介導(dǎo)引起內(nèi)分泌干擾作用。本論文以正壬基酚(4-n-NP)以及12種4-NP異構(gòu)體單體為研究對象,以Sertoli TM4細(xì)胞為靶細(xì)胞,運用細(xì)胞和分子生物學(xué)技術(shù),從細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和內(nèi)分泌干擾兩個方面研究4-NP異構(gòu)體對TM4細(xì)胞的影響及其相關(guān)的分子機制,并通過比較差異探討4-NP異構(gòu)體的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)與其活性的相關(guān)性。本文主要研究內(nèi)容和結(jié)論歸納如下:1.4-NP異構(gòu)體對Sertoli TM4細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用采用MTT法檢測細(xì)胞存活率以及流式檢測細(xì)胞凋亡,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在低濃度時,NP9、NP10以及NP37促進(jìn)TM4細(xì)胞的生長,4-n-NP、NP65、NP70、NP111、NP112、NP143、NP152、NP194處理顯著誘導(dǎo)TM4細(xì)胞的凋亡,由此可見除4-n-NP外,壬基取代基主碳鏈長、取代基支鏈小(甲基)的壬基酚異構(gòu)體可促進(jìn)TM4細(xì)胞增殖;碳鏈越短、α-C位置取代基基團越大越復(fù)雜的壬基酚異構(gòu)體對Sertoli TM4細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)越強。4-NP異構(gòu)體主要是通過引起細(xì)胞氧化損傷以及與ROS生成相關(guān)的線粒體信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在80-100μM時,所有4-NP異構(gòu)體通過直接毒性作用顯著降低TM4細(xì)胞的存活率。2.4-NP異構(gòu)體對Sertoli TM4細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)的影響用4-NP異構(gòu)體處理細(xì)胞24 h后檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化及引起其變化的相關(guān)機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn),NP65、NP70、NP111、NP112、NP143、NP152、NP194暴露能夠上調(diào)TM4細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度,其中NP65、NP70、NP111、NP152作用顯著。4-NP異構(gòu)體對Sertoli TM4內(nèi)鈣離子的調(diào)控作用與Ca2+-ATPase活性,鈣泵功能,鈣離子通道激酶等因素有關(guān)�？梢娙苫尤〈鶑�(fù)雜、體積大(具有乙基或丙基取代基)的異構(gòu)體易導(dǎo)致tm4細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度紊亂。3.4-np異構(gòu)體對sertolitm4細(xì)胞內(nèi)mapk、akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響采用westernblot的方法檢測了4-np異構(gòu)體對細(xì)胞內(nèi)mapk信號通路和akt信號通路的影響。4-n-np、np41、np42、np65、np111、np112、np143、np152均能激活jnk信號通路;4-n-np、np111、np112、np143、np152、np194能夠激活p38信號通路;np143、np152、np194對erk信號通路無影響,其他異構(gòu)體激活或抑制erk通路。4-n-np抑制akt信號通路,其他所有檢測的np異構(gòu)體能夠激活akt信號通路。除4-n-np外,壬基取代基大、α-c處取代基復(fù)雜的異構(gòu)體可激活jnk、p38信號通路,而對erk信號通路無影響;碳鏈長、壬基取代基簡單的異構(gòu)體主要表現(xiàn)抑制jnk、p38信號通路。4.4-np異構(gòu)體對sertolitm4細(xì)胞激素受體和分泌功能的影響4-n-np能夠降低tm4細(xì)胞內(nèi)er-β的表達(dá),下調(diào)細(xì)胞連接相關(guān)分子的表達(dá),上調(diào)abp的分泌,下調(diào)inhibinb的分泌,且能增加tm4細(xì)胞對il-1α、tnf-α、tgf-β1等的分泌,降低tm4細(xì)胞對no的分泌和inos的表達(dá)。12種4-np異構(gòu)體對tm4細(xì)胞激素受體、連接相關(guān)分子的表達(dá)以及內(nèi)分泌功能均具有不同程度的影響,4-np異構(gòu)體可通過激素受體、連接相關(guān)分子的表達(dá)以及內(nèi)分泌功能對tm4細(xì)胞產(chǎn)生損傷。5.4-np異構(gòu)體對sertolitm4細(xì)胞內(nèi)激素分泌及其分子機制的研究4-np異構(gòu)體作用于細(xì)胞后,以pge2為代表觀察4-np異構(gòu)體對tm4細(xì)胞分泌激素的影響及其機制。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),4-n-np、np10、np41、np42、np70暴露能夠誘導(dǎo)tm4細(xì)胞內(nèi)cox-2的表達(dá)和pge2的釋放;np9、np37、np65對tm4細(xì)胞內(nèi)pge2的釋放無顯著影響;np111、np112、np143、np152、np194可抑制tm4細(xì)胞對pge2的釋放�？梢�,壬基取代基主鏈長(6-7)且在β-c有取代基的異構(gòu)體刺激cox-2的表達(dá)和pge2、il-6的分泌;側(cè)鏈主鏈短(4-5)、在α-c處取代基比較大且復(fù)雜(乙基或丙基)的np異構(gòu)體抑制tm4細(xì)胞分泌pge2和il-6。4-n-np通過ros誘導(dǎo)的nf-κb信號通路調(diào)節(jié)cox-2的表達(dá)和pge2的釋放。綜上所述,4-np異構(gòu)體能夠通過細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(包括線粒體細(xì)胞凋亡信號通路,鈣離子通道以及mapk、akt信號通路)和內(nèi)分泌干擾作用(包括對激素受體,細(xì)胞連接相關(guān)分子以及內(nèi)分泌的影響)對sertolitm4細(xì)胞發(fā)揮作用,且各異構(gòu)體對TM4細(xì)胞各方面的影響存在一定差異,壬基酚異構(gòu)體對Sertoli TM4細(xì)胞的影響可能與其側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的鏈長、大小、α-C和β-C處取代基等因素有關(guān)。
【學(xué)位單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：X592
【部分圖文】：

本研究總體思路圖

圖 2.1 4-n-NP 及 12 種 4-NP 異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)式。*代表手性碳原子。Fig 2.1 Structures of 4-n-NP and 4-NP isomers. *represents chiral carbon atom.NP152NP143NP194

-n-NP 對 TM4 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。通過流式采用 Fluo-3/AM 檢測，檢測 20000 個細(xì)胞。 4-n-NP-induced Ca2+release in TM4 cells. The appearance of Ca2+release wasow cytometry using Fluo-3/AM fluorescent probe. For each sample, 20,000 cellanalyzed.-NP 異構(gòu)體對 TM4 細(xì)胞凋亡的影響 不同濃度 NP65對 Sertoli TM4 細(xì)胞凋亡的影響S 的過量生成是氧化應(yīng)激的一個指示劑，氧化應(yīng)激被認(rèn)為是細(xì)胞個主要機制，本研究中采用流式檢測了 NP65對 Sertoli TM4 凋亡察了 ROS 在 NP65誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用，結(jié)果如圖 2.6 所示，T處理24 h后，凋亡細(xì)胞在10 和 20 μM NP65處理組顯著增加（P <低濃度 NP65處理組（0.1 和 1 μM），凋亡細(xì)胞比例與對照組無顯定 ROS 是否參與了 NP65對 TM4 細(xì)胞的凋亡作用，本研究在 NP6

本文編號：2875596