發(fā)布時(shí)間：2020-11-04 23:34

　　 近年來,抗生素耐藥性被認(rèn)為是一個(gè)危害公共健康的全球性問題�？股啬退幓�(antibiotic resistance genes,ARGs)已逐漸被作為一類新型環(huán)境污染物而備受關(guān)注。ARGs可通過水平轉(zhuǎn)移和垂直傳播從人和動(dòng)物源進(jìn)入受納環(huán)境。畜禽養(yǎng)殖業(yè)中抗生素的大量使用促進(jìn)了ARGs的產(chǎn)生和傳播擴(kuò)散。畜禽糞便、糞水回用農(nóng)田土壤,可增加ARGs從動(dòng)物源到環(huán)境的輸入。但ARGs在畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中的污染特征及其向受納環(huán)境的遷移過程機(jī)理尚不清楚,因此,有必要開展典型畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs的多樣性分布特征和傳播擴(kuò)散機(jī)制研究。本研究選取不同養(yǎng)殖模式的肉雞養(yǎng)殖環(huán)境、集約化養(yǎng)豬場(chǎng)及其受納環(huán)境作為研究對(duì)象,系統(tǒng)研究了抗生素和抗生素ARGs在養(yǎng)殖動(dòng)物糞便、廢水、養(yǎng)殖場(chǎng)周邊土壤、種植作物以及受納河流水體和沉積物中的污染特征;探討了ARGs組成的時(shí)空分布特征和各環(huán)境因子(抗生素、金屬和環(huán)境質(zhì)量參數(shù))之間的關(guān)系;并采用16S rRNA基因測(cè)序和宏基因組測(cè)序深入解析了ARGs和細(xì)菌耐藥性在典型養(yǎng)殖環(huán)境中的遷移擴(kuò)散規(guī)律。本研究主要的研究成果如下:(1)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),表征了兩種典型肉雞養(yǎng)殖模式(山地放養(yǎng)和室內(nèi)平養(yǎng))11個(gè)肉雞場(chǎng)環(huán)境樣品中介導(dǎo)氯霉素類、磺胺類和四環(huán)素類ARGs的含量和分布特征。通過Pearson相關(guān)性分析和多因子冗余分析(RDA)進(jìn)一步分析了ARGs可能的分子傳播過程和環(huán)境影響因素(抗生素殘留、金屬含量及常見環(huán)境質(zhì)量參數(shù))。定量結(jié)果表明,ARGs廣泛分布于肉雞糞便、墊料、土壤、池塘水和沉積物中,能夠在糞便或墊料中富集,并長(zhǎng)期存在于養(yǎng)殖環(huán)境介質(zhì)中,其中氯霉素類和磺胺類ARGs檢出含量高于四環(huán)素類ARGs。室內(nèi)平養(yǎng)模式和山地放養(yǎng)模式下的ARGs豐度特征各異,表明養(yǎng)殖方式對(duì)ARGs的產(chǎn)生和傳播擴(kuò)散有重要影響。Pearson相關(guān)性分析顯示,ARGs與1類和2類整合子的整合酶編碼基因呈現(xiàn)顯著正相關(guān),表明移動(dòng)元件對(duì)ARGs的傳播擴(kuò)散起到一定作用。同時(shí)不同作用機(jī)制類型ARGs之間的顯著相關(guān)性則表明多重耐藥、共選擇及協(xié)同傳播等分子機(jī)制可能有助于其在肉雞養(yǎng)殖環(huán)境中的傳播。進(jìn)一步的線性回歸分析結(jié)果表明,fexA、sul1和tetW基因可作為肉雞養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs的污染指示基因(fexA、sul1和tetW與所有ARGs總值相關(guān)系數(shù)分別為:0.95、0.96和0.86,p0.01)。冗余分析結(jié)果顯示,ARGs的環(huán)境分布受到抗生素殘留、金屬含量和常見環(huán)境質(zhì)量參數(shù)的影響,表明ARGs的傳播擴(kuò)散與環(huán)境化學(xué)因子相關(guān)。(2)考察了磺胺類、四環(huán)素類、氯霉素類和大環(huán)內(nèi)酯類共計(jì)22種ARGs以及18種對(duì)應(yīng)抗生素在典型養(yǎng)豬場(chǎng)環(huán)境中含量水平和污染特征。結(jié)果表明,args和抗生素在生豬養(yǎng)殖環(huán)境中普遍存在,大部分args和抗生素通過養(yǎng)豬場(chǎng)內(nèi)的廢水處理單元無法有效去除。args隨廢水排放和糞肥回用進(jìn)入河流和農(nóng)業(yè)土壤后呈現(xiàn)組成多樣性增加的趨勢(shì)。args在農(nóng)田土壤垂直剖面上呈現(xiàn)出向下富集的趨勢(shì),表明其垂直遷移性。另外,需要特別關(guān)注的是args及部分抗生素在種植蔬菜中均有檢出,說明養(yǎng)豬場(chǎng)糞便和廢水回用可能對(duì)食品安全和人體健康形成的潛在影響。(3)通過比較分析養(yǎng)豬場(chǎng)、養(yǎng)雞場(chǎng)及相應(yīng)受納環(huán)境中26個(gè)args和2個(gè)整合酶基因的分布特征,探討了不同養(yǎng)殖類型對(duì)受納環(huán)境的影響。結(jié)果表明,豬糞比雞糞負(fù)載更多的args(p0.01),兩類養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)受納土壤args的輸入在總量上稍有體現(xiàn),并且豬場(chǎng)的輸入量大于雞場(chǎng)。args檢出率在兩類糞便及其受納土壤中的檢出率顯著高于對(duì)照土壤。兩類糞便中args的多樣性與其對(duì)應(yīng)受納土壤中的args多樣性相當(dāng)。但值得注意的是,豬場(chǎng)受納土壤中args多樣性顯著高于對(duì)照土壤(p0.05),而雞場(chǎng)受納土壤的多樣性僅略高于對(duì)照土壤(p0.05)。不同類型養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)受納土壤的影響進(jìn)一步體現(xiàn)在args的多樣化程度上,相比而言,豬場(chǎng)比雞場(chǎng)更易促進(jìn)args在土壤中的多樣化進(jìn)程�？傮w而言,args在兩類養(yǎng)殖場(chǎng)水體環(huán)境中的相對(duì)含量分布差異較大,養(yǎng)豬場(chǎng)高于養(yǎng)雞場(chǎng),水相高于沉積物相,養(yǎng)豬場(chǎng)對(duì)周邊環(huán)境的影響大于養(yǎng)雞場(chǎng)。(4)基于16srrna高通量測(cè)序,分析了養(yǎng)豬廢水處理過程及其出水灌溉對(duì)土壤及其種植蔬菜微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果顯示,養(yǎng)豬廢水經(jīng)過儲(chǔ)污池、沼氣池等單元處理后,微生物群落多樣性指數(shù)有所升高。蔬菜清洗后仍可發(fā)現(xiàn)較多微生物群落。與對(duì)照樣比較,豬場(chǎng)地下水(井水)、蔬菜地土壤、魚塘水及其沉積物的微生物組成差異顯著。89種菌群在蔬菜土壤中得到了富集,養(yǎng)豬廢水和蔬菜土壤共有19個(gè)核心菌群,廢水中檢出動(dòng)物腸道來源的變形菌門、擬桿菌門、厚壁門細(xì)菌等。養(yǎng)豬廢水灌溉農(nóng)田不僅將args、多種潛在病原微生物從養(yǎng)豬場(chǎng)輸入到環(huán)境中,也對(duì)水、土、及農(nóng)作物微生物結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響,進(jìn)而可能對(duì)生態(tài)環(huán)境與人群健康形成潛在威脅。(5)采用宏基因組學(xué)測(cè)序技術(shù)對(duì)經(jīng)豬糞水灌溉的蔬菜地土壤柱(表層、中層、底層土)中args組組成和垂直遷移擴(kuò)散機(jī)理進(jìn)行了深入解析。通過宏基因測(cè)序共獲得79種args基因型,分屬于12大類。豬場(chǎng)蔬菜地表層、中層、底層土的args數(shù)量比對(duì)照菜地分別高出5.70倍、14.7倍、5.93倍。豬場(chǎng)菜地的灌溉水則比對(duì)照地的高出11.9倍。值得注意的是,兩類菜地底層土的args序列總量均高于中層土和表層土。灌溉水中差異最大的args是四環(huán)素類,其次是氨基糖苷類和mlsb。氨基糖苷類、氯霉素類、磺胺類和四環(huán)素類是表層土中相差較大的ARGs類別。多藥外排泵、磺胺類、四環(huán)素類在中層土中相差較大,而氨基糖苷類、桿菌肽和磺胺類在底層土中的差異較突出。整個(gè)土壤柱樣相差最大的是磺胺類,其次是四環(huán)素類、多藥外排泵。8個(gè)樣品共獲得59種潛在病原菌,分屬于8個(gè)門、12個(gè)綱、18個(gè)目、27個(gè)科、30個(gè)屬;病原菌在種(species)分類水平上,土壤表層、中層、底層剖面上的差異倍數(shù)范圍在-0.38~64.0倍、0.58~200倍、-1.00~1.94倍。8個(gè)樣品共獲得451種耐藥菌,分屬于18個(gè)門、35個(gè)綱、79個(gè)目、150個(gè)科、254個(gè)屬。耐藥菌在種(species)分類水平上,土壤表層、中層、底層剖面上的差異倍數(shù)范圍在-1.00~255倍、-1.00~848倍、-1.00~113倍。Piper三線圖顯示了12類ARGs和150個(gè)科水平上的耐藥菌在土壤剖面上的分布格局。絕大多數(shù)耐藥菌在對(duì)照土壤柱樣中主要分布在底層,部分菌種可在三層均勻分布;而耐藥菌在豬場(chǎng)蔬菜地三層土壤中的分布較為均勻。ARGs與耐藥菌的分布呈現(xiàn)出相似的格局:在對(duì)照菜地中主要分布在表層、底層;而豬場(chǎng)菜地中三層均有分布。以上結(jié)果表明,微生物種群分布特征主導(dǎo)了ARGs在土壤中的分布格局,對(duì)土壤耐藥基因組的演化起重要作用。
【學(xué)位單位】：中國(guó)科學(xué)院研究生院(廣州地球化學(xué)研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：X713
【文章目錄】：
致謝
摘要
ABSTRACT
中英文對(duì)照及縮略詞表
第一章 緒論
    第一節(jié) 抗生素及其在畜禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用
        一、抗生素種類、作用機(jī)制及其在畜禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用
        二、抗生素在畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中的分布和影響
    第二節(jié) 抗生素耐藥性
        一、抗生素耐藥機(jī)制和代表性耐藥基因
        二、耐藥基因的遷移與傳播擴(kuò)散機(jī)制
        三、耐藥基因的研究方法
    第三節(jié) 抗生素耐藥基因在畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中的污染特征
        一、畜禽養(yǎng)殖廢棄物的處理與資源化利用
        二、畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素耐藥基因的污染水平
    第四節(jié) 研究意義、思路和內(nèi)容
        一、研究意義
        二、研究思路和內(nèi)容
第二章 研究方法
    第一節(jié) 研究區(qū)域
        一、養(yǎng)雞場(chǎng)
        二、養(yǎng)豬場(chǎng)
    第二節(jié) 樣品采集
        一、采樣前期準(zhǔn)備
        二、樣品采集與前處理方法
        三、養(yǎng)雞場(chǎng)樣品采集
        四、養(yǎng)豬場(chǎng)樣品采集
        五、土壤柱及其灌溉水樣品采集
        六、蔬菜樣品采集與前處理
        七、樣品總清單
    第三節(jié) 化學(xué)分析
        一、常規(guī)環(huán)境質(zhì)量參數(shù)
        二、金屬含量
        三、抗生素
    第四節(jié) 生物分析
        一、樣品總DNA提取
        二、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR）
        三、耐藥基因熒光定量PCR檢測(cè)（SYBR® Green I染料法）
    第五節(jié) 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析
        一、描述性統(tǒng)計(jì)分析
        二、香農(nóng)多樣性指數(shù)
        三、基于生態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)處理的雙向聚類樣品分級(jí)
        四、基于生態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)處理的多變量分析
    第六節(jié) 16S rRNA基因測(cè)序與生物信息學(xué)分析
        一、16S rRNA基因測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程
        二、基于 16S rRNA基因測(cè)序的微生物多樣性分析
    第七節(jié) 宏基因組測(cè)與及生物信息學(xué)分析
        一、宏基因組測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程
        二、宏基因組測(cè)序生物信息學(xué)分析
第三章 抗生素耐藥基因在肉雞養(yǎng)殖環(huán)境中的污染特征
    第一節(jié) 結(jié)果
        一、肉雞養(yǎng)殖環(huán)境中耐藥基因的污染特征
        二、肉雞養(yǎng)殖環(huán)境中的抗生素和金屬的污染特征
        三、肉雞養(yǎng)殖環(huán)境中耐藥基因與金屬、抗生素及環(huán)境質(zhì)量參數(shù)的相關(guān)性分析
        四、耐藥基因含量分布與環(huán)境因子的多變量分析
    第二節(jié) 討論
        一、兩種養(yǎng)殖模式下耐藥基因的分布特征和分子傳播機(jī)制
        二、養(yǎng)殖環(huán)境中耐藥基因污染指示基因的篩查
        三、環(huán)境因子對(duì)耐藥基因時(shí)空分布的影響
    第三節(jié) 小結(jié)
第四章 抗生素耐藥基因在生豬養(yǎng)殖環(huán)境中的污染特征
    第一節(jié) 結(jié)果
        一、水樣、土壤樣品常規(guī)質(zhì)量指標(biāo)與金屬含量
        二、耐藥基因在養(yǎng)豬場(chǎng)及其受納環(huán)境中的分布特征
        三、耐藥基因在蔬菜中的分布特征
        四、抗生素在養(yǎng)豬場(chǎng)環(huán)境中的分布特征
    第二節(jié) 討論
        一、耐藥基因從養(yǎng)豬場(chǎng)到受納環(huán)境的傳輸和擴(kuò)散過程
        二、養(yǎng)豬場(chǎng)對(duì)受納環(huán)境中抗生素和耐藥基因的輸入與影響
    第三節(jié) 不同養(yǎng)殖類型對(duì)受納環(huán)境中耐藥基因輸入的影響差異
    第四節(jié) 小結(jié)
第五章 養(yǎng)殖廢水處理與灌溉過程中耐藥基因和微生物種群結(jié)構(gòu)的演變過程
    第一節(jié) 16S rRNA測(cè)序結(jié)果與討論
        一、各樣本測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
        二、OTU聚類與微生物組成分析
        三、多樣本相似度分析
        四、群落結(jié)構(gòu)與耐藥基因的關(guān)聯(lián)性分析（考慮是否去掉）
        五、微生物群落LefSe差異統(tǒng)計(jì)分析
    第二節(jié) 宏基因組測(cè)序結(jié)果與討論
        一、環(huán)境質(zhì)量參數(shù)、ARGs及抗生素含量水平
        二、宏基因組測(cè)序基礎(chǔ)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
        三、微生物群落組成結(jié)構(gòu)特征
        四、潛在病原菌組成結(jié)構(gòu)特征
        五、潛在耐藥菌組成結(jié)構(gòu)特征
        六、COG功能注釋
        七、耐藥基因注釋
        八、耐藥基因與耐藥菌在土壤柱中的分布格局
    第三節(jié) 小結(jié)
第六章 全文結(jié)論及創(chuàng)新之處
    第一節(jié) 主要結(jié)論
    第二節(jié) 主要?jiǎng)?chuàng)新之處
    第三節(jié) 不足之處
    第四節(jié) 研究展望
參考文獻(xiàn)
作者簡(jiǎn)介及在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前4條

1 袁素芬;微污染化學(xué)物質(zhì)分析方法的建立及其應(yīng)用[D];華南理工大學(xué);2017年

2 李新;纖維素對(duì)污泥中多環(huán)芳烴厭氧生物降解的影響研究[D];貴州大學(xué);2017年

3 趙晶;施有機(jī)肥對(duì)土壤及生菜中耐藥非致病菌及耐藥基因的影響研究[D];華東師范大學(xué);2017年

4 史亞楠;重金屬銅鋅對(duì)病原菌及環(huán)境細(xì)菌耐藥性的影響[D];廣東藥科大學(xué);2017年

本文編號(hào)：2870770