赤潮是一種世界性海洋災(zāi)難,嚴(yán)重影響海洋生態(tài)環(huán)境和海洋漁業(yè),給人體健康帶來(lái)嚴(yán)重的威脅。因此,尋找有效的預(yù)防與治療赤潮的措施是亟需解決的重要海洋環(huán)境問(wèn)題。近年來(lái),植物化感作用在防治赤潮方面展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景,為尋找高效、環(huán)境友好的抑藻方法提供了新的思路。為增強(qiáng)抗逆性,耐鹽植物常含有特殊的化學(xué)成分以增強(qiáng)環(huán)境適應(yīng)能力,是尋找抑藻化感物質(zhì)的重要資源。黃酮化合物是一類(lèi)廣泛存在于植物中的化感物質(zhì),其抑藻化感作用近年來(lái)逐漸引起人們的重視。因此,研究規(guī)�；苽潼S酮化合物的方法尤為重要。本論文尋找到能用于不同植物中黃酮化合物分離的大孔樹(shù)脂,對(duì)黃酮化合物在大孔樹(shù)脂上的吸附行為進(jìn)行了研究,并建立了大孔樹(shù)脂純化幾種耐鹽植物中黃酮化合物的工藝路線。最后,對(duì)分離的黃酮化合物進(jìn)行抑藻活性評(píng)價(jià),為尋找環(huán)境友好型天然抑藻劑提供依據(jù),也為耐鹽植物在赤潮防治方面的資源應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下:1.大孔樹(shù)脂的篩選及吸附行為研究。選擇黃酮含量高、所含黃酮結(jié)構(gòu)明確的山楂葉為模型植物,篩選了對(duì)植物中黃酮化合物具有較好吸附及解吸性能的大孔樹(shù)脂HPD-300和HPD-400。樹(shù)脂的比表面積越大,吸附能力越強(qiáng);樹(shù)脂孔徑越小,吸附能力越強(qiáng)。通過(guò)掃描電鏡對(duì)吸附前后的大孔樹(shù)脂微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)HPD-300和HPD-400樹(shù)脂吸附樣品前表面為粗糙的多孔結(jié)構(gòu),吸附后變得平整光滑,更加致密,說(shuō)明其多孔的表面有利于吸附。使用紅外光譜對(duì)吸附山楂葉提取物前后的樹(shù)脂結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征,可明顯看到樣品已被樹(shù)脂吸附,但樹(shù)脂的官能團(tuán)吸收峰未見(jiàn)明顯變化,說(shuō)明樣品不是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)與樹(shù)脂結(jié)合。吸附動(dòng)力學(xué)研究表明,HPD-400樹(shù)脂對(duì)山楂葉總黃酮的吸附速率比HPD-300樹(shù)脂快,說(shuō)明黃酮化合物在樹(shù)脂孔徑內(nèi)部擴(kuò)散時(shí)受到阻力不同,孔徑大的樹(shù)脂阻力較小,吸附速率較快。山楂葉總黃酮在兩種樹(shù)脂上的吸附動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)均符合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型,吸附過(guò)程除了受顆粒內(nèi)擴(kuò)散過(guò)程的控制外,還可能受液膜擴(kuò)散過(guò)程的影響。吸附熱力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Langmuir吸附等溫線模型可以更好地描述山楂葉總黃酮在HPD-300樹(shù)脂上的吸附行為,說(shuō)明山楂葉總黃酮在HPD-300樹(shù)脂上的吸附為單分子層吸附,且為放熱、自發(fā)的物理過(guò)程。優(yōu)化了HPD-300樹(shù)脂純化山楂葉總黃酮的工藝條件。經(jīng)HPD-300樹(shù)脂純化后,山楂葉總黃酮含量由23.75%增加到58.05%,回收率為81.88%。建立了HPD-400樹(shù)脂-制備HPLC技術(shù)純化山楂葉中牡荊素葡萄糖苷和牡荊素鼠李糖苷的工藝路線。經(jīng)樹(shù)脂分離后,兩種化合物的含量分別從0.720%和2.63%提高到6.08%和22.2%,回收率分別為79.1%和81.2%。經(jīng)制備HPLC分離后,得到純度大于96%的牡荊素葡萄糖苷和牡荊素鼠李糖苷單體。2.HPD-300樹(shù)脂分離大葉白麻葉黃酮化合物的研究。以耐鹽植物大葉白麻為研究對(duì)象,對(duì)模型植物的樹(shù)脂篩選結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證,HPD-300樹(shù)脂對(duì)耐鹽植物中黃酮化合物也具有最好的靜態(tài)吸附能力,進(jìn)一步說(shuō)明比表面積是影響樹(shù)脂吸附能力的重要因素。黃酮化合物在樹(shù)脂上的吸附量主要與其在植物中的含量有關(guān),含量越高,吸附量越大。不同結(jié)構(gòu)的黃酮在不同性質(zhì)樹(shù)脂上的相對(duì)吸附能力(吸附率)順序一致,主要與黃酮化合物結(jié)構(gòu)有關(guān)(包括苷元的結(jié)構(gòu)及所含糖基的個(gè)數(shù)等)。苷元上羥基數(shù)目對(duì)黃酮化合物在樹(shù)脂上吸附率影響較大,說(shuō)明黃酮化合物主要通過(guò)疏水性苷元與樹(shù)脂的聚苯乙烯骨架結(jié)合。另外,所有測(cè)試樹(shù)脂對(duì)綠原酸吸附能力均較差,吸附率低于10%,說(shuō)明黃酮苷元芳香環(huán)與樹(shù)脂苯環(huán)間可能還通過(guò)π-π相互作用結(jié)合。利用HPD-300樹(shù)脂—Sephadex LH-20柱層析聯(lián)用建立了大葉白麻葉中白麻苷和異槲皮苷分離的工藝路線。經(jīng)樹(shù)脂純化后,白麻苷的含量從2.16%提高到21.34%,異槲皮苷的含量從1.26%提高到10.70%,收率分別為82.1%和77.3%。樹(shù)脂純化后的產(chǎn)物,經(jīng)Sephadex LH-20柱層析分離后,得到純度分別為93.5%和97.6%的白麻苷和異槲皮苷。吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明,兩種化合物在HPD-300樹(shù)脂上的吸附過(guò)程均符合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。顆粒內(nèi)擴(kuò)散模型擬合結(jié)果顯示吸附速率可能由顆粒內(nèi)擴(kuò)散和液膜擴(kuò)散共同控制。熱力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Langmuir吸附等溫線模型能較好地描述兩種化合物的吸附行為。HPD-300樹(shù)脂對(duì)兩種黃酮苷的吸附為單分子層吸附,是自發(fā)的物理吸附過(guò)程。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明HPD-300樹(shù)脂對(duì)耐鹽植物中黃酮化合物也具有較好的分離效果。3.HPD-300樹(shù)脂在檉柳枝葉和荷葉中黃酮化合物分離中的應(yīng)用。通過(guò)HPLC-MS技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)典型耐鹽植物檉柳枝葉中含有多種黃酮硫酸酯類(lèi)化合物。利用酸提-HPD-300樹(shù)脂—硅膠柱色譜聯(lián)用技術(shù),優(yōu)化了山奈甲黃素和槲皮素-3′,4′-二甲醚的分離工藝,得到純度高于97%的兩種單體化合物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HPD-300樹(shù)脂既適合分離黃酮苷類(lèi)化合物,也可用于游離黃酮化合物的分離。利用HPD-300樹(shù)脂-硅膠柱色譜聯(lián)用建立了濕地植物荷葉中的槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的分離工藝,可得到純度大于97%的單體化合物,進(jìn)一步證實(shí)HPD-300樹(shù)脂適用于分離不同植物中的黃酮化合物。4.黃酮化合物的抑藻活性評(píng)價(jià)。中肋骨條藻是我國(guó)近海岸爆發(fā)頻率較高的典型赤潮藻,論文評(píng)價(jià)了分離的黃酮化合物對(duì)中肋骨條藻生長(zhǎng)的抑制作用。結(jié)果表明,檉柳枝葉中的山奈甲黃素具有最強(qiáng)的抑制作用,培養(yǎng)3 d后EC_(50)為16.70μM。槲皮素-3′,4′-二甲醚的抑藻作用相對(duì)較弱,EC_(50)為99.76μM,可能與其在海水中溶解度較差有關(guān)。槲皮素及其氧苷衍生物白麻苷、異槲皮苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷也有較強(qiáng)的抑制作用,培養(yǎng)3 d后的EC_(50)分別為35.56μM、19.98μM、24.16μM和34.18μM。其中,異槲皮苷、白麻苷和山奈甲黃素和的抑藻活性強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照硫酸銅。兩種黃酮碳苷化合物牡荊素葡萄糖苷和牡荊素鼠李糖苷表現(xiàn)出微弱的抑藻活性,最高濃度下抑制率僅為30%-40%左右。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,樹(shù)脂比表面積和孔徑對(duì)吸附能力影響較大,樹(shù)脂主要吸附黃酮化合物的疏水性母核,黃酮苷元與樹(shù)脂苯環(huán)之間的π-π相互作用對(duì)吸附也有一定貢獻(xiàn)。篩選的HPD-300樹(shù)脂適合分離不同植物中的黃酮化合物,黃酮化合物在HPD-300樹(shù)脂上的吸附動(dòng)力學(xué)符合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程,吸附速率受到顆粒內(nèi)擴(kuò)散和液膜擴(kuò)散的控制。黃酮化合物在HPD-300樹(shù)脂上的吸附為放熱、自發(fā)的單分子層物理吸附。利用大孔樹(shù)脂HPD-300建立的黃酮分離工藝路線可靠、簡(jiǎn)便、環(huán)保、價(jià)廉,為其他植物中黃酮化合物的大孔樹(shù)脂分離提供了依據(jù)。從耐鹽植物大葉白麻葉和檉柳枝葉中分離的黃酮化合物具有顯著抑制赤潮藻中肋骨條藻生長(zhǎng)的作用,有望開(kāi)發(fā)成為環(huán)境友好型的抑藻劑。
【學(xué)位單位】：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：X55
【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 赤潮的危害與防治
        1.1.1 赤潮的危害
        1.1.2 赤潮的防治
    1.2 植物抑藻化感作用研究進(jìn)展
        1.2.1 具有抑藻化感作用的植物
        1.2.2 抑藻化感物質(zhì)研究進(jìn)展
    1.3 化感物質(zhì)黃酮化合物的抑藻活性、藥理作用及提取分離方法研究進(jìn)展
        1.3.1 黃酮化合物的抑藻化感作用
        1.3.2 黃酮化合物的藥理活性
        1.3.3 黃酮化合物的提取方法
        1.3.4 黃酮化合物的分離方法
        1.3.5 大孔吸附樹(shù)脂概況
        1.3.6 大孔吸附樹(shù)脂在黃酮類(lèi)化合物分離純化中的應(yīng)用進(jìn)展
    1.4 課題研究目標(biāo)和內(nèi)容
        1.4.1 研究目標(biāo)
        1.4.2 研究?jī)?nèi)容
第2章 大孔樹(shù)脂的篩選及對(duì)黃酮化合物的吸附行為研究
    2.1 儀器與材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.2 材料與試劑
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 大孔吸附樹(shù)脂的預(yù)處理
        2.2.2 山楂葉提取物溶液的配制
        2.2.3 總黃酮含量的測(cè)定
        2.2.4 液相色譜與液質(zhì)聯(lián)用分析條件
        2.2.5 VOG和VOR的含量測(cè)定方法
        2.2.6 靜態(tài)吸附解吸實(shí)驗(yàn)
        2.2.7 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)
        2.2.8 靜態(tài)吸附等溫線的測(cè)定
        2.2.9 吸附熱力學(xué)參數(shù)計(jì)算
        2.2.10 動(dòng)態(tài)吸附解吸實(shí)驗(yàn)
        2.2.11 紅外光譜測(cè)定
        2.2.12 掃描電鏡測(cè)定
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 山楂葉提取物中黃酮化合物的結(jié)構(gòu)分析
        2.3.2 大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附/解吸能力
        2.3.3 吸附前后大孔吸附樹(shù)脂微觀形態(tài)的變化
        2.3.4 吸附前后大孔樹(shù)脂結(jié)構(gòu)的紅外光譜表征
        2.3.5 HPD-300樹(shù)脂分離HFL的研究
        2.3.6 HPD-400樹(shù)脂分離山楂葉提取物中VOG和VOR的研究
    2.4 結(jié)論
第3章 HPD-300樹(shù)脂對(duì)大葉白麻葉中黃酮化合物的分離效果研究
    3.1 儀器與材料
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        3.1.2 材料與試劑
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 大葉白麻葉的提取和樣品溶液的配制
        3.2.2 液相色譜分析條件
        3.2.3 液質(zhì)聯(lián)用分析條件
        3.2.4 各化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
        3.2.5 靜態(tài)吸附解吸實(shí)驗(yàn)
        3.2.6 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)
        3.2.7 靜態(tài)吸附等溫線的測(cè)定
        3.2.8 動(dòng)態(tài)吸附解吸實(shí)驗(yàn)
        3.2.9 QOS和ISO的凝膠柱色譜分離
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 大葉白麻葉提取物中所含化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)分析
        3.3.2 QOS和ISO在大孔樹(shù)脂上的靜態(tài)吸附/解吸能力
        3.3.3 黃酮化合物結(jié)構(gòu)對(duì)吸附能力和吸附率的影響
        3.3.4 吸附動(dòng)力學(xué)研究
        3.3.5 吸附等溫線研究
        3.3.6 吸附熱力學(xué)參數(shù)
        3.3.7 上樣濃度的影響
        3.3.8 泄漏曲線
        3.3.9 洗脫曲線
        3.3.10 產(chǎn)物分析
        3.3.11 QOS和ISO的凝膠柱色譜分離
        3.3.12 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定
    3.4 結(jié)論
第4章 HPD-300樹(shù)脂在檉柳枝葉黃酮化合物分離中的應(yīng)用
    4.1 儀器與材料
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        4.1.2 材料與試劑
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 檉柳枝葉的提取
        4.2.2 檉柳枝葉提取物色譜及液質(zhì)聯(lián)用分析條件
        4.2.3 檉柳枝葉的酸提取
        4.2.4 QDM和MK的含量測(cè)定
        4.2.5 QDM和MK的HPD-300樹(shù)脂分離
        4.2.6 QDM和MK的硅膠柱色譜分離
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 檉柳枝葉提取物中黃酮化合物的結(jié)構(gòu)分析
        4.3.2 檉柳枝葉酸提物中黃酮化合物的結(jié)構(gòu)分析
        4.3.3 QDM和MK在HPD-300樹(shù)脂上的泄漏曲線
        4.3.4 QDM和MK在HPD-300樹(shù)脂上的洗脫曲線
        4.3.5 QDM和MK的硅膠柱色譜分離
        4.3.6 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定
    4.4 結(jié)論
第5章 HPD-300樹(shù)脂在荷葉黃酮化合物分離中的應(yīng)用
    5.1 儀器與材料
        5.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        5.1.2 材料與試劑
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 荷葉的提取
        5.2.2 總黃酮的含量測(cè)定
        5.2.3 荷葉提取物HPLC分析色譜條件
        5.2.4 動(dòng)態(tài)吸附解吸實(shí)驗(yàn)
        5.2.5 化合物1的硅膠柱色譜分離
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 泄漏曲線
        5.3.2 洗脫曲線
        5.3.3 產(chǎn)物分析
        5.3.4 化合物1的硅膠柱色譜分離
        5.3.5 化合物1的結(jié)構(gòu)鑒定
    5.4 結(jié)論
第6章 黃酮化合物的抑藻化感作用評(píng)價(jià)
    6.1 儀器與材料
        6.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        6.1.2 材料與試劑
    6.2 實(shí)驗(yàn)方法
        6.2.1 藻種的培養(yǎng)
        6.2.2 抑藻化感能力測(cè)試
        6.2.3 數(shù)據(jù)處理
    6.3 結(jié)果與討論
        6.3.1 黃酮化合物對(duì)中肋骨條藻的抑藻化感作用評(píng)價(jià)
        6.3.2 不同黃酮化合物抑制中肋骨條藻生長(zhǎng)的半效應(yīng)濃度（EC50）
        6.3.3 B環(huán)取代基對(duì)游離黃酮抑藻化感能力的影響
        6.3.4 糖基對(duì)抑藻化感能力的影響
        6.3.5 苷原子的類(lèi)型對(duì)抑藻化感能力的影響
    6.4 結(jié)論
第7章 結(jié)論與展望
    7.1 主要結(jié)論
    7.2 創(chuàng)新點(diǎn)
    7.3 展望
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)歷及攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果

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