近幾十年來(lái),米氏凱倫藻藻華在我國(guó)近岸海域頻頻暴發(fā),致使海水養(yǎng)殖生物,如魚(yú)類(lèi)與貝類(lèi)大規(guī)模死亡,導(dǎo)致重大經(jīng)濟(jì)損失。其中,2012年福建省米氏凱倫藻藻華暴發(fā),導(dǎo)致大量養(yǎng)殖貝類(lèi)死亡,經(jīng)濟(jì)損失達(dá)20.11億元,引起廣泛關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)研究了該藻對(duì)受災(zāi)生物皺紋盤(pán)鮑的影響。但該藻藻華對(duì)海洋中其它生物的危害效應(yīng)與原因目前并不清楚。本文選取了2012年福建省藻華區(qū)分離的一株米氏凱倫藻,在實(shí)驗(yàn)室條件下探究了該藻對(duì)幾種典型海洋生物的危害效應(yīng)與毒理機(jī)制,以求探討福建省米氏凱倫藻藻華對(duì)海洋生態(tài)的影響與其原因。本文首先探究了米氏凱倫藻對(duì)幾種典型海洋生物,包括褶皺臂尾輪蟲(chóng)、鹵蟲(chóng)和黑褐新糠蝦幼蝦,黃東海浮游動(dòng)物關(guān)鍵種中華哲水蚤,養(yǎng)殖生物南美白對(duì)蝦幼蝦和大菱鲆幼魚(yú)的急性毒性。結(jié)果顯示,該藻在藻華密度下(3×10~4 cells/m L)對(duì)所有實(shí)驗(yàn)生物的存活率都有著極顯著的影響,實(shí)驗(yàn)進(jìn)行96 h后,各實(shí)驗(yàn)生物死亡率分別為100、23、20、97、33、53%,其中輪蟲(chóng)對(duì)該藻最為敏感,在藻密度約30 cells/mL時(shí)24 h存活率為57%。米氏凱倫藻在溶解氧較高的情況下仍能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)生物死亡,而且非曝氣條件能加劇該藻對(duì)大菱鲆的毒性效應(yīng)。這說(shuō)明米氏凱倫藻對(duì)海洋中不同營(yíng)養(yǎng)級(jí)生物的存活都有著不利影響,而且這種影響來(lái)源于藻本身的毒性;在水體缺氧的條件下,米氏凱倫藻藻華可能會(huì)對(duì)生物產(chǎn)生更強(qiáng)烈的影響,從而破壞海洋生態(tài)環(huán)境,并嚴(yán)重威脅鄰近海域的海水養(yǎng)殖業(yè)。本文進(jìn)一步探究了米氏凱倫藻對(duì)褶皺臂尾輪蟲(chóng)行為、結(jié)構(gòu)和酶活性的影響。顯微觀察發(fā)現(xiàn),受到該藻影響,輪蟲(chóng)立即出現(xiàn)了劇烈的回避反應(yīng),游泳能力逐漸減弱,并產(chǎn)生粘液,最終纖毛停止擺動(dòng),失去活性。結(jié)合掃描電鏡的觀察結(jié)果顯示,在米氏凱倫藻影響下,輪蟲(chóng)身體結(jié)構(gòu)短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)明顯的變化,個(gè)體逐漸失水皺縮,纖毛明顯脫落,輪盤(pán)出現(xiàn)囊泡與潰爛的情況。這表明米氏凱倫藻能夠顯著影響輪蟲(chóng)的行為,并在短時(shí)間內(nèi)破壞其身體結(jié)構(gòu)。米氏凱倫藻在低密度下(30、30、300、1000 cells/m L)就能夠分別顯著抑制輪蟲(chóng)酯酶(Esterase)、乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase)、總ATP酶活性與Na~+-K~+-ATP酶的活性。這說(shuō)明米氏凱倫藻低密度下就能夠顯著影響輪蟲(chóng)體內(nèi)多種酶的活性,從而可能對(duì)其體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)、能量代謝與物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程產(chǎn)生不利影響。為探究米氏凱倫藻的毒理機(jī)制,本文首先分析了米氏凱倫藻毒性的來(lái)源,探究了該藻不同組分對(duì)六種實(shí)驗(yàn)生物的毒性,同時(shí)利用隔離、凍干、重懸等手段進(jìn)一步探究其對(duì)褶皺臂尾輪蟲(chóng)的毒性特性。結(jié)果顯示,只有細(xì)胞重懸液對(duì)所有實(shí)驗(yàn)生物的存活有著顯著影響,去藻過(guò)濾液與細(xì)胞破碎液對(duì)實(shí)驗(yàn)生物的存活都沒(méi)有顯著影響。利用3μm濾膜將藻細(xì)胞與輪蟲(chóng)隔離或是將藻細(xì)胞凍干后,該藻對(duì)輪蟲(chóng)存活并無(wú)顯著影響。這表明米氏凱倫藻的毒性來(lái)自于存活的藻細(xì)胞,并與接觸相關(guān),其毒性物質(zhì)可能附著在藻細(xì)胞膜上。離心重懸后米氏凱倫藻對(duì)輪蟲(chóng)毒性明顯減弱,但會(huì)隨時(shí)間逐漸恢復(fù),這表明米氏凱倫藻毒性可能與藻細(xì)胞活性有關(guān)。本文還驗(yàn)證了活性氧在米氏凱倫藻毒理機(jī)制中的作用,結(jié)果顯示,米氏凱倫藻中超氧陰離子(·O_2~-)與過(guò)氧化氫(H_2O_2)的含量分別為0.014±0.004 OD/(10~4cells)與3.00±0.00 nmol/(10~4 cells),但利用活性氧酶類(lèi)將活性氧去除后,該藻對(duì)輪蟲(chóng)的毒性并沒(méi)有顯著變化。而且能顯著影響輪蟲(chóng)存活的過(guò)氧化氫濃度是米氏凱倫藻含量的幾十倍;受該藻影響的輪蟲(chóng)也沒(méi)有表現(xiàn)出受到明顯的氧化壓力的情況。這說(shuō)明活性氧并不是米氏凱倫藻導(dǎo)致輪蟲(chóng)死亡的主要原因。本文同時(shí)探究了米氏凱倫藻脂溶性毒素對(duì)生物的影響效應(yīng),結(jié)果顯示,該藻氯仿甲醇提取物在藻華濃度下對(duì)六種實(shí)驗(yàn)生物的存活都沒(méi)有顯著影響,這說(shuō)明米氏凱倫藻脂溶性毒素可能并不能夠直接對(duì)生物產(chǎn)生影響。不同介質(zhì)與手段提取的物質(zhì)對(duì)輪蟲(chóng)的毒性有著明顯的差異,其中低溫氮吹法(0℃)提取物的毒性明顯高于懸蒸法提取物(30-60℃),這表明米氏凱倫藻毒性物質(zhì)可能不耐高溫,在提取過(guò)程中有所損耗。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,米氏凱倫藻能夠顯著抑制不同營(yíng)養(yǎng)級(jí)生物,包括浮游生物與養(yǎng)殖生物的存活,這說(shuō)明福建省米氏凱倫藻藻華能夠?qū)Ｑ笊鷳B(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生不利影響,威脅當(dāng)?shù)睾ＫB(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。這種影響來(lái)源與藻本身的毒性,并與存活的完整藻細(xì)胞相關(guān)。米氏凱倫藻還能夠顯著影響褶皺臂尾輪蟲(chóng)的行為與身體結(jié)構(gòu),并抑制輪蟲(chóng)體內(nèi)多種酶的活性。米氏凱倫藻對(duì)輪蟲(chóng)的毒性與接觸相關(guān)。藻細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧與脂溶性毒素可能并不是米氏凱倫藻導(dǎo)致生物死亡的主要原因。
【學(xué)位單位】：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院海洋研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：X171.5
【部分圖文】：

圖 1.1 米氏凱倫藻產(chǎn)生的糖脂類(lèi)物質(zhì)Fig 1.1 Hemolytic glycoglycerolipids produced by Karenia mikimotoi細(xì)胞毒性毒性是指某些生物或物質(zhì)能夠?qū)?xì)胞產(chǎn)生不利影響，能夠抑制正常外細(xì)胞生長(zhǎng)周期，引起細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡的作用（郭輝革，201細(xì)胞毒性的物質(zhì)被稱(chēng)為細(xì)胞毒素。與溶血毒素類(lèi)似，細(xì)胞毒素也屬效應(yīng)分類(lèi)的毒素，所以細(xì)胞毒素同樣也包含很多種，如多環(huán)有機(jī)物細(xì)胞毒素能抑制胞內(nèi)物質(zhì)的合成與運(yùn)輸，影響細(xì)胞核內(nèi) DNA 的復(fù)分裂、誘導(dǎo)細(xì)胞衰亡（郭輝革，2014）。部分細(xì)胞毒素在實(shí)際表現(xiàn)作用相類(lèi)似，都能夠?qū)е录?xì)胞損傷或死亡，但是也有部分細(xì)胞毒素正常分裂與增殖，抑制生物發(fā)育或是致畸。

圖 2.1 米氏凱倫藻（福建株）對(duì)（A）褶皺臂尾輪蟲(chóng)、（B）鹵蟲(chóng)、（C）黑褐新糠蝦、（D）中華哲水蚤、（E）南美白對(duì)蝦、（F）大菱鲆存活率的影響。無(wú)菌海水作為空白組；與 3×104cells/mL 米氏凱倫藻等生物量密度的小球藻（約 3×107cells/mL）或金藻（約9×106cells/mL）作為實(shí)驗(yàn)組。黑色表示實(shí)驗(yàn)組初次與對(duì)照組出現(xiàn)顯著差異時(shí)實(shí)驗(yàn)生物的存活率；灰色表示實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)實(shí)驗(yàn)生物的存活率，星號(hào)表示與對(duì)照組差異是否顯著（*表示差異顯著，p<0.05；**表示差異極顯著，p<0.01）。柱狀圖上標(biāo)公式為實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)生物存活率（y）與米氏凱倫藻密度（x）的相關(guān)方程與相關(guān)系數(shù)（R2）。Fig 2.1 Effect of K. mikimotoi on B. plicatilis(A), A. salina(B), N. awatschensis(C), C.sinicus(D), P. vannamei(E), S. maximus(F) at different densities, with autoclaved seawater aloneas blank, and Chlorella sp. or I. galbana of same biomass density as 3×104cells/mLK. mikimotoias control. Columns indicate the mean of triplicate measurements at K. mikimotoi first cause a

在非曝氣條件下，大菱鲆在 1×104、3×104cells/mL 米3h 內(nèi)就全部死亡。而與在第二章第一節(jié)該藻對(duì)大菱鲆急性毒性下，大菱鲆只受到最高藻密度組（3×104cells/mL）顯著影響， 46.67±5.77%（圖 2.1）。這說(shuō)明非曝氣條件會(huì)加強(qiáng)米氏凱倫藻實(shí)驗(yàn)水體中溶解氧水平檢測(cè)表明，在實(shí)驗(yàn)期間，1×104、3×104倫藻導(dǎo)致大菱鲆顯著死亡時(shí)，實(shí)驗(yàn)水體中溶解氧均處于較高41ppm）。這與曝氣條件下，實(shí)驗(yàn)水體中溶解氧水平差異并不是很空白組中，大菱鲆在溶解氧低至 2.15ppm 的情況下依然能夠存較高的情況下米氏凱倫藻就能夠顯著影響大菱鲆存活率。時(shí)發(fā)現(xiàn)，在 1-3h 內(nèi)，5000、500cells/mL 密度組溶解氧濃度變化（要顯著低于空白組（1.83ppm）和對(duì)照組（1.80ppm），這說(shuō)明低了大菱鲆利用氧氣的能力。
【參考文獻(xiàn)】

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