酞酸酯(Phthalate acid esters,PAEs)是一類典型的難降解有機(jī)污染物,具有內(nèi)分泌干擾特性。本文從選育高效降解鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯(Di-(2-ethylehxyl)phthalate,DEHP)的微生物入手,從近海岸潮間帶塑料制品污染的底泥中篩選出一株DEHP高效降解菌YC-YT1,對(duì)其降解DEHP的生物降解特性進(jìn)行了研究;通過全基因組測(cè)序獲得了菌株YC-YT1完整的遺傳信息,利用比較基因組學(xué)和生物信息學(xué)預(yù)測(cè)并獲取了降解相關(guān)的基因;借助傳統(tǒng)分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合物質(zhì)代謝途徑分析,對(duì)相關(guān)降解酶進(jìn)行功能驗(yàn)證。本論文研究成果如下:(1)從近海岸潮間帶塑料制品污染的底泥中篩選出一株DEHP高效降解菌YC-YT1,經(jīng)鑒定為赤紅球菌(Rhodococcus ruber)。該菌株能在72小時(shí)內(nèi)完全降解100 mg/L DEHP,并且可高效降解13種不同類型的酞酸酯化合物和多種芳香族化合物;此外,YC-YT1能有效降解低濃度的DEHP,是現(xiàn)今已報(bào)道的DEHP降解菌中底物譜最寬、低濃度DEHP利用率最高的赤紅球菌,為環(huán)境修復(fù)酞酸酯污染物儲(chǔ)備了降解菌資源;(2)菌株YC-YT1在不同環(huán)境條件下降解DEHP能力的單因素研究,結(jié)果表明YC-YT1對(duì)溫度、pH和鹽離子濃度都擁有較高的耐受度,菌株的接種量對(duì)降解能力無明顯影響,添加一定量的葡萄糖可明顯提升菌株的降解能力;采用響應(yīng)面法對(duì)有顯著影響的單因素進(jìn)行了組合優(yōu)化,菌株最優(yōu)降解條件為額外添加5.0 g/L葡萄糖,pH 7.5,溫度33℃;(3)液相/質(zhì)譜分析檢測(cè)了菌株YC-YT1降解DEHP過程中的中間產(chǎn)物,DEHP首先降解生成鄰苯二甲酸單(2-乙基己)酯(MEHP),繼而生成鄰苯二甲酸再進(jìn)一步進(jìn)入三羧酸循環(huán)。此外,菌株YC-YT1通過調(diào)整其細(xì)胞表面疏水性(Cell surface hydrophobicity,CSH)獲取了良好的環(huán)境適應(yīng)能力,可修復(fù)79.7%-95.9%的污染土壤和水體,在生物修復(fù)被DEHP污染的鹽堿性環(huán)境上具有巨大的應(yīng)用潛能。(4)利用Pac Boi三代測(cè)序平臺(tái)對(duì)菌株YC-YT1進(jìn)行了全基因組測(cè)序,序列提交至Gen Bank(CP023712)。菌株YC-YT1包括一個(gè)環(huán)狀基因組(5.66 Mb,GC含量70.41%)和兩個(gè)質(zhì)粒(plasmid01,159 Kb,GC含量67.2%;plasmid02,77 Kb,GC含量64.92%),共預(yù)測(cè)到5525個(gè)CDS,其中5375個(gè)CDS被注釋到公共數(shù)據(jù)庫(97%);通過同源比對(duì)結(jié)合比較基因組學(xué)分析,挖掘參與DEHP降解的基因和基因簇,詳細(xì)分析了酞酸酯雙加氧酶基因和苯環(huán)雙加氧酶基因,涉及聯(lián)苯、鄰苯二酚、原兒茶酸、苯甲酸和鄰苯二甲酸等物質(zhì)的降解;獲得了兩個(gè)參與DEHP降解的新型酯酶基因Dehp1199和Mehp4077,并對(duì)Dehp1199基因進(jìn)行了功能驗(yàn)證和酶學(xué)特征分析,發(fā)現(xiàn)Dehp1199酯酶比現(xiàn)今已報(bào)道的DEHP降解酶有較寬的p H和溫度適應(yīng)范圍、更好的穩(wěn)定耐受力,為DEHP降解酶的開發(fā),改造提供了重要資源。
【學(xué)位單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：X172;X592
【部分圖文】：

圖 1.1 鄰苯二甲酸酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 1.1 The chemical structureof表 1.1 典型的鄰苯二甲酸酯Table 1.1 Typicalphthalateacid 英文名稱 DimethylPhthalate DiethylPhthalate DipropylPhthalate DiisobutylPhthalate Di-n-butylPhthalate Di-n-pentylPhthalate Dihexyl Phthalate ButylbenzylPhthalate Di(2-ethylhexyl) Phthalate Di-n-octylPhthalate

2 酞酸酯化合物的危害及管控長期以來，PAEs 作為增塑劑的塑料制品，因制造成本低，綜合理化不受限制地生產(chǎn)和應(yīng)用(曾鋒等，1999)。然而上個(gè)世紀(jì) 70 年代，在人s(Oakley et al., 1973)，學(xué)者們就 PAEs 的毒性和致癌問題開始了激烈的酞酸酯具有高毒性、致畸性、致癌性和致突變性以及生殖毒性(Liang即使微量的 PAEs 仍可擾亂動(dòng)物的多種內(nèi)分泌生化效應(yīng)，因此將其歸ang et al., 2013; Benson R, 2009)。陳榮圻研究顯示，盡管 DEHP 的急量（LD50）大于 25 g/kg，Ames 試驗(yàn)陰性，但大劑量作用下表現(xiàn)出較2016)。酞酸酯是一類全球廣泛使用的污染物之一，1995 年世界衛(wèi)生組染物是一類需要必須被控制使用的化合物(Xiao et al., 2014)，世界野環(huán)境激素名單(孫增榮，2010)，可見 PAEs 已被世界內(nèi)多數(shù)國家列為存在的潛在風(fēng)險(xiǎn)極度關(guān)注（priority pollutant）(Chao et al., 2006)。其中鄰二甲酸二（2-乙基己）酯（DEHP）、鄰苯二甲酸二正丁酯（DBP）、鄰苯二二甲酸二正辛酯（DOP）等 6 種鄰苯二甲酸酯被美國 EPA 列為優(yōu)先控如圖 1.2，部分 PAEs 的毒性數(shù)據(jù)見表 1.5。

圖 1.3 增塑劑 DEHP 毒性效應(yīng)及其機(jī)制示意圖Figure 1.3 The schematic of thetoxicity effect of plasticizer DEHPand itsmechanism典型酞酸酯 DEHP 概述苯二甲酸二（2-乙基己）酯（Di-(2-ethylhexyl) phthalate, DEHP），化學(xué)式為 C6H4(CO2C8H子質(zhì)量 390.6，比例最高可達(dá) 60-70% (Wang et al., 2015; Xia et al., 2011)。DEHP 是最 PAEs 化合物，也是使用最廣和產(chǎn)量最大的塑化劑，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：圖 1.4 DEHP 的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Figure 1.4 The chemical structureof DEHPEHP 被廣泛使用的原因在于其綜合性能良好，如增塑效率高，柔韌度好，耐熱性良好
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