鄰苯二甲酸二丁酯(DBP),是塑料工業(yè)中廣泛使用的增塑劑,DBP具有環(huán)境激素效應(yīng),其生物毒性強(qiáng),在環(huán)境中難以自然降解。功能微生物在與污染物接觸時(shí),其細(xì)胞表面發(fā)生復(fù)雜的物理、化學(xué)和生物作用,污染物首先要通過細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)而被微生物利用。了解功能菌株在降解DBP過程中細(xì)胞界面行為及菌株生長(zhǎng)代謝變化對(duì)于環(huán)境中DBP降解和開發(fā)高效修復(fù)技術(shù)具有重要意義。本研究在長(zhǎng)期使用塑料農(nóng)膜的設(shè)施土壤中篩選到一株DBP降解菌DNB-S2,考察外源物質(zhì)腐殖酸及其模擬物蒽醌-2,6-磺酸鈉(AQDS)的添加對(duì)于菌株分解去除污染物DBP效能的影響。將DBP降解菌DNB-S2分別在LB培養(yǎng)液,培養(yǎng)液(1)DBP 50 mg·L-1,(2)DBP 50 mg·L-1并添加AQDS100或500 umol·L-1,(3)DBP 50 mg·L-1并添加腐殖酸250或500 mg·L-1。圍繞外源調(diào)控作用下菌株降解DBP過程中菌體細(xì)胞界面反應(yīng)機(jī)制及菌體細(xì)胞脅迫響應(yīng)等涉及的關(guān)鍵科學(xué)問題開展研究,考察外源物質(zhì)添加對(duì)于強(qiáng)化降解菌株功能基因表達(dá)量的影響,在基因水平上揭示外源調(diào)控下微生物降解DBP的分子機(jī)理。研究的主要結(jié)果如下:降解菌株DNB-S2經(jīng)16S r DNA鑒定與Gen Bank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析確定為腸桿菌屬(Enterobacterium sp.),Gen Bank獲得登錄號(hào)為KY469198。在72h內(nèi)可將濃度為50、100、200、500和1000mg·L-1 DBP降解95.46%、93.91%、95.81%、72.31%和70.2%。培養(yǎng)液中加入100 umol·L-1 AQDS和250 mg·L-1腐殖酸能夠?qū)⒕暝?2h內(nèi)對(duì)濃度為500mg·L-1DBP降解率提高至83.12%和84.39%。通過測(cè)定不同生長(zhǎng)時(shí)期菌株胞外聚合物(EPS)中主要成分多糖和蛋白質(zhì)及所含官能團(tuán)變化,菌株表面疏水性(CSH)和Zeta電位變化考察菌株DNB-S2與污染物DBP相互作用時(shí)菌體細(xì)胞界面的變化過程。結(jié)果表明,菌株DNB-S2的EPS中含有C-H疏水基團(tuán),能夠主動(dòng)捕獲環(huán)境中DBP。外源AQDS和腐殖酸的加入使菌株EPS中多糖含量升高,蛋白質(zhì)含量下降,CSH顯著升高,但對(duì)Zeta電位影響不大。表明外源物質(zhì)AQDS和腐殖酸通過提高菌株DNB-S2的CSH促進(jìn)其與疏水性有機(jī)污染物DBP靠近和接觸,為菌株對(duì)DBP進(jìn)行生物降解奠定了基礎(chǔ)。利用流式細(xì)胞儀研究不同培養(yǎng)條件下菌株DNB-S2細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞膜的完整性。使用氣相色譜質(zhì)譜儀GC-MS測(cè)定菌株DNB-S2細(xì)胞膜中脂肪酸的組成及變化情況,通過分析脂肪酸的飽和度研究不同培養(yǎng)條件下菌株細(xì)胞膜的流動(dòng)性。結(jié)果表明,DBP可導(dǎo)致DNB-S2細(xì)胞的大小和胞內(nèi)顆粒密度發(fā)生不同程改變度的變化,破壞DNB-S2細(xì)胞膜的完整性。外源AQDS和腐殖酸的加入減少了培養(yǎng)體系中細(xì)胞膜損傷的細(xì)胞數(shù)量,保護(hù)了細(xì)胞膜的完整性。GC-MS在菌株DNB-S2細(xì)胞膜上共檢測(cè)到17種脂肪酸。DBP使菌株在生長(zhǎng)遲緩期和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期脂肪酸總量出現(xiàn)下降。外源AQDS和腐殖酸可提高菌株中不飽和脂肪酸含量使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)變的疏松,增加細(xì)胞膜流動(dòng)性,增加菌株DNB-S2對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)能力。菌株DNB-S2在不同培養(yǎng)條件下總抗氧化能力T-AOC變化結(jié)果表明外源AQDS可以提高菌株DNB-S2的抗氧化水平。DBP降低了菌株對(duì)ROS的清除能力,表明DNB-S2雖然能夠?qū)BP進(jìn)行生物降解但仍然受到DBP的氧化脅迫。外源AQDS對(duì)菌株胞內(nèi)酶清除O2-·能力沒有較大影響,但能夠提高對(duì)·OH和H2O2的清除能力,這將減少H2O2與O2-·反應(yīng)生成毒性更大的·OH,減少菌株受到毒性更大的·OH自由基產(chǎn)生的氧化脅迫,提高菌株的抗氧化能力。透射電鏡觀察結(jié)果表明DBP能夠使部分功能菌出現(xiàn)細(xì)胞形狀不規(guī)則,胞外分泌物減少,細(xì)胞質(zhì)模糊,細(xì)胞壁破碎,細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)量減少甚至出現(xiàn)空泡,菌株微觀形態(tài)改變,外源處理明顯改善了菌株超微結(jié)構(gòu)的變化。在菌株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期取樣,對(duì)4個(gè)處理3次生物學(xué)重復(fù)共計(jì)12個(gè)樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,每個(gè)樣品平均產(chǎn)出1.30 Gb數(shù)據(jù),與參考基因組的平均比對(duì)率為94.63%。與對(duì)照組相比,DBP脅迫處理的菌株出現(xiàn)上調(diào)基因10個(gè),下調(diào)基因18個(gè)。添加外源AQDS處理的菌株出現(xiàn)上調(diào)基因53個(gè),下調(diào)基因95個(gè)。添加外源腐殖酸處理的菌株出現(xiàn)上調(diào)基因113個(gè),下調(diào)基因300個(gè)。將獲得差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能分析和KEGG Pathway分析,結(jié)果表明DBP使菌株DNB-S2的細(xì)胞功能和代謝路徑發(fā)生改變,特別是細(xì)胞膜和細(xì)胞膜組成相關(guān)基因表達(dá)量改變。外源AQDS和腐殖酸通過提高趨化性基因表達(dá)量增強(qiáng)了菌株DNB-S2與DBP結(jié)合能力。通過提高細(xì)胞膜固定組分基因表達(dá)量減小DBP通過細(xì)胞膜時(shí)對(duì)細(xì)胞膜損傷。通過提高苯酸類物質(zhì)降解基因增加了DBP中間代謝產(chǎn)物苯酸類物質(zhì)的降解能力,同時(shí)使谷胱甘肽代謝基因正常表達(dá)維持菌株抗氧化系統(tǒng)功能的穩(wěn)定性,進(jìn)而促使菌株DNB-S2更好的發(fā)揮生物功能以應(yīng)對(duì)環(huán)境中DBP脅迫提高降解能力。
【學(xué)位單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：X592;X172
【部分圖文】：

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)博士學(xué)位論文環(huán)境中 DBP 的至關(guān)重要。大量研究表明腐殖酸及其模擬物蒽醌-2,6-磺酸鈉（AQDS）可有效促進(jìn)微生物對(duì)優(yōu)先污染物的降解。然而，利用其促進(jìn)功能微生物對(duì) PAEs 化合物的降解研究相對(duì)較少。本試驗(yàn)以優(yōu)先控制污染物 DBP 為研究對(duì)象，在長(zhǎng)期受塑料農(nóng)膜污染的農(nóng)業(yè)實(shí)施土壤中篩選降解菌株，經(jīng)鑒定后為降解菌為 Enterobacter sp.命名為 DNB-S2。通過外源添加腐殖酸及其模擬物 AQDS，圍繞外源調(diào)控作用下菌株降解 DBP 過程中菌體細(xì)胞界面反應(yīng)機(jī)制及菌體細(xì)胞脅迫響應(yīng)等涉及的關(guān)鍵科學(xué)問題開展研究。借助現(xiàn)代分子生物技術(shù)中轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，深入考察外源物質(zhì)添加對(duì)于強(qiáng)化降解菌株功能基因表達(dá)量的影響，在基因水平上揭示外源調(diào)控下微生物降解 DBP 的分子機(jī)理。1.4.2.2 技術(shù)路線

圖 2-1 37 種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)曲線（20 ppm）Fig.2-1 The standard curve of 37 kinds of fatty acids（20 ppm）2.3.4 細(xì)菌酶活性測(cè)定2.3.4.1 細(xì)胞破碎將培養(yǎng)一定時(shí)間的菌懸液以 6000 rpm 常溫離心 5 min，棄上清，菌體用滅菌的 PBS 洗滌2 次，隨后重懸于 5 mL PBS 緩沖液中，利用超聲細(xì)胞破碎儀在冰浴條件下進(jìn)行菌體破壁。超聲破壁 10 min（超 3 s，停 3 s）。之后離心（6000 rpm min-1，10 min，4℃），分離棄去細(xì)胞壁和細(xì)胞碎屑沉淀，上清液為細(xì)胞內(nèi)含物，低溫保存。2.3.4.2 蛋白質(zhì)含量分析本試驗(yàn)中利用考馬斯亮藍(lán) G-250 法進(jìn)行樣品中蛋白質(zhì)含量分析[119]。2.3.4.3 ATP 酶活性測(cè)定本試驗(yàn)根據(jù)南京建成生物試劑公司生物試劑盒 A070-6 中方法測(cè)定細(xì)菌 Ca2+Mg2+-ATP，Na+K+-ATP 和 T-ATP 酶活性。

圖 2-2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析流程Fig.2-2 Transcriptome analysis process序?qū)嶒?yàn)步驟：將不同處理的菌株按 2.2總 RNA，為保證 RNA 質(zhì)量利用 Nanod0 檢測(cè) RNA 完整性。待 RNA 樣品合格試劑在 Thermomixer 中適溫將 mRNA隨機(jī)引物合成一鏈 cDNA，然后然后加，并使用試劑盒純化回收、粘性末端修雙鏈 cDNA 進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)nt 2100 Bioanalyzer 和 ABI StepOnePluseqTM 2000 測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。）中含有的少量接頭污染及低質(zhì)量的 Reads、N(不確定堿基)含量比例大于 10ads�？刂茊蝹�(gè)堿基位置的測(cè)序錯(cuò)誤率的堿基質(zhì)量值用 Phred quality score 表概率 P，則堿基的 Phred quality score 為
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2861268