發(fā)布時(shí)間：2020-10-27 05:09

　　 有機(jī)磷水解酶廣泛用于生物降解有機(jī)磷農(nóng)藥殘留和神經(jīng)毒劑,對(duì)環(huán)境污染修復(fù)和保障人體健康具有重大意義。磷酸三酯酶OPH和甲基對(duì)硫磷水解酶MPH(亦稱甲基對(duì)硫磷降解酶MPD)的研究較為深入。野生菌OPH和MPD降解有機(jī)磷農(nóng)藥或有機(jī)磷神經(jīng)毒劑(如G類毒劑沙林、梭曼或模擬物氟磷酸二異丙酯DFP)活性很低,不能滿足快速消毒要求。蛋白質(zhì)工程構(gòu)建有機(jī)磷神經(jīng)毒劑高效降解酶和優(yōu)化酶催化環(huán)境是提高磷酸三酯酶水解效率的主要途徑,也是當(dāng)前生物消毒技術(shù)的研究熱點(diǎn)。P-F鍵屬于難徹底水解的磷酯鍵,與G類神經(jīng)毒劑產(chǎn)生生物學(xué)毒性有著直接關(guān)系。DFP是研究P-F鍵型有機(jī)磷毒劑水解機(jī)制的最佳模擬劑。本研究從有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌中克隆了有機(jī)磷降解酶基因mpd和oph,構(gòu)建了原核表達(dá)基因工程菌;定點(diǎn)突變成功構(gòu)建了高效降解DFP的重組有機(jī)磷水解酶(rOPHm和rMPDm),并進(jìn)一步研究了乙醇胺類介質(zhì)對(duì)該酶的增效機(jī)制。主要結(jié)果如下:1、以施氏假單胞菌PseudomonasstutzeriHS-D36和黃桿菌Flavobacterium sp.ATCC 27551 基因組為模板,成功克隆到甲基對(duì)硫磷水解酶mpd基因和有機(jī)磷水解酶oph基因。oph基因全長1014 bp,編碼337個(gè)氨基酸;mpd基因全長996 bp,編碼331個(gè)氨基酸。成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-oph和pET-mpd,并在E.coli獲得高效表達(dá);SDS-PAGE電泳顯示重組OPH和MPD分子量分別為37 KDa和36KDa;它們的最佳誘導(dǎo)條件分別為18℃、1.0mMIPTG和37℃、1.0mMIPTG。2、以野生型OPH(PDB:1dpm)和MPD(PDB:1p9e)為模板,對(duì)重組OPH和MPD進(jìn)行同源模建。模型顯示OPH和MPD同為同源二聚體,活性空腔均含有雙核金屬。OPH單體為(α—β)8折疊,雙核金屬為Zn2+。MPD單體含有一個(gè)β-lactamase,雙核金屬為一個(gè)Zn2+和一個(gè)Cd2+。酶活性中心的底物結(jié)合部位由三個(gè)疏水口袋組成:OPH離去基團(tuán)口袋由W102、F103、F277和Y280組成;MPD離去基團(tuán)口袋為F119、W179和F196殘基構(gòu)成。分子對(duì)接顯示F103、L111、S72、A147等氨基酸是OPH催化水解DFP的必需基團(tuán),且F103是優(yōu)化OPH催化功能的關(guān)鍵靶點(diǎn)。突變酶的F103Y和底物DFP(或過渡態(tài))的對(duì)接值明顯升高;Y103的酚羥基可以和DFP形成氫鍵,有利于DFP的水解。OPH和MPD的活性部位結(jié)構(gòu)相似,推測(cè)相應(yīng)位置的氨基酸殘基也影響MPD的活性。采用反向PCR、重疊延伸PCR等基因工程技術(shù),成功構(gòu)建了 14種突變酶:6種rOPHm和8種rMPDm。這14種突變酶基因均在E.coli BL21中得到可溶性表達(dá);突變?yōu)門yr的突變體對(duì)DFP的水解活性都有不同程度的提高。結(jié)合分子建模信息,證明103位點(diǎn)是控制OPH催化活性的關(guān)鍵氨基酸殘基;F119、W179和F196對(duì)MPD的活性有很大影響。3、親和色譜分離純化得到電泳純重組OPH和MPD,進(jìn)而分析乙醇胺類、胺類和醇類催化介質(zhì)對(duì)rOPH和rMPD水解DFP/MP的影響。結(jié)果顯示,乙醇胺類能增效OPH水解DFP,且作用效果三乙醇胺(TEA)二乙醇胺(DEA)乙醇胺(MEA)。增效劑介質(zhì)中的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)符合米氏方程。TEA增效能力在0-400 mM范圍內(nèi)與增效劑濃度正相關(guān)。不同TEA濃度下的酶動(dòng)力學(xué)均符合米氏方程,證明增效劑不改變r(jià)OPH和rMPD的米氏酶屬性。乙醇胺類增效劑顯著提高了DFP酶促水解的動(dòng)力學(xué)參數(shù)kcat、Vm和kcat/Km。相比之下,胺類增效能力較弱;醇類沒有明顯增效作用。氟離子(DFP水解產(chǎn)物)抑制動(dòng)力學(xué)分析證明:抑制劑(1-3mMNaF)降低rOPH與DFP的親和力(Km升高)和抑制DFP酶促水解(kcat和Vm下降));加入TEA可以部分消除這種產(chǎn)物抑制效應(yīng)。3 mMNaF導(dǎo)致rOPH活性下降約80%;添加300 mM TEA,rOPH動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vm和kcat/Km均提高到無抑制劑(對(duì)照)水平,分別為106.1 ± 1.1 μMmin-1和36.23 ± 5.07 mM-1 s-s。線性作圖證明氟離子為線性混合型抑制劑;在0、100、200和300 mMTEA條件下Ki值分別為3.21、5.17、5.45和7.51 mM,證明TTEA增效動(dòng)力學(xué)機(jī)制在于緩解氟離子產(chǎn)物抑制。重組OPH/MPD水解MP/PO的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km、kcat、kcat/Km和Vm基本不變,說明乙醇胺對(duì)rOPH/rMPD水解MP/PO增效作用不明顯,即乙醇胺類介質(zhì)作用P-O鍵型的底物水解的效果不大;表明該類增效介質(zhì)僅對(duì)P-F鍵具有專一性。TEA能夠促進(jìn)rOPHm/rMPDm水解DFP的效率,對(duì)突變?yōu)門yr的突變體效果更強(qiáng),而對(duì)突變?yōu)锳la的突變體效果很弱。進(jìn)一步證明乙醇胺增效依賴于OPH/MPD活性中心控制產(chǎn)物釋放的氨基酸殘基。
【學(xué)位單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：X592
【部分圖文】：

壯學(xué)位論文??ＤＯＣＴＯＲＡＬ?ＤＩＳＳＩ－ＲＴＡＴＩＯＮ??金屬由Ｈ２０１和Ｈ２３０穩(wěn)定（圖１．ＳＢ）?［１１９，?１２（）Ｉ。ＯＰＨ催化需要一或兩個(gè)金屬離子，天然酶利用??Ｚｎ２＋，二價(jià)金屬離子Ｃｏ２＋、Ｃｄ２＋、Ｍｎ２＋或Ｎｉ２＋可以取代Ｚｎ２＋參與催化［１１９，１２１］。??圖１．５?ＰＴＥ的晶體結(jié)構(gòu)［３］??Ａ：?ＰＴＥ的單體結(jié)構(gòu)；Ｂ：?ＰＴＥ的金屬結(jié)合部位；Ｃ：?ＰＴＥ的底物結(jié)合口袋??Ｆｉｇ．?１．５?Ｃｒｙｓｔａｌ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ＰＴＥ?（ｐｄｂ．?ｌｄｐｍ）??Ａ：?ＴＩＭ－Ｂａｒｒｅｌ?ｆｏｌｄ?ｏｆ?ＰＴＥ；?Ｂ：?Ｍｅｔａｌ?ｂｉｎｄｉｎｇ?ｓｉｔｅ?ｏｆ?ＰＴＥ；?Ｃ：?Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ?ｂｉｎｄｉｎｇ?ｐｏｃｋｅｔｓ?ｏｆ?ＰＴＥ??ＯＰＨ最適底物是對(duì)氧磷，而對(duì)有機(jī)磷神經(jīng)毒劑活性較弱（表１．３）?［１（）７，１２２，１２３］。酶活性中心??有三個(gè)疏水口袋，分別與底物分子的三個(gè)取代基作用，影響離去基團(tuán)釋放速率，并決定酶的專??一性。大口袋（Ｈ２５４、Ｈ２５７?和?Ｌ２７１）和小口袋（Ｍ３１７、Ｇ６０、１１０６、Ｌ３０３?和?Ｓ３０８）對(duì)于酶??識(shí)別底物側(cè)鏈?zhǔn)杷院椭行牧自邮中允种匾�；口袋（Ｗ１３１、Ｆ１３２、Ｆ３０６和Ｙ３０９）則控制??離去基團(tuán)釋放［１＜＞５］。??表１．３?ＯＰＨ對(duì)不同ＯＰ化合物的活性比較［１（）７

２００３年，中國科學(xué)院武漢病毒所張先恩課題組首次從假單胞菌ｆｔ＾ｆｏＯＴｏ／ｊｏｓ?ｓｐ．?ＷＢＣ－３克??隆表達(dá)了?ＭＰＤ，隨后在２．４Ａ水平上解析了該酶蛋白的晶體結(jié)構(gòu)［１２４，?１２＼結(jié)構(gòu)生物學(xué)證據(jù)表明??ＭＰＤ是二聚體蛋白，單體折疊成典型的ｐ－ｌａｃｔａｍａｓｅ花式ａｐ／ｐａ?（圖１．６Ａ），與ＴＩＭ－桶折疊有??明顯區(qū)別［１２￣。ＭＰＤ單體含有３３１個(gè)氨基酸殘基，分子量約３５?ｋＤａ。ＭＰＤ和ＰＴＥ的雙核金屬??中心結(jié)構(gòu)相似，但參與穩(wěn)定金屬離子的氨基酸殘基不同［１２４］。值得注意的是，ＭＰＤ活性依賴于??Ｃｄ２＋，Ｘ－射線晶體結(jié)構(gòu)和電子密度解析都證明該酶的雙核金屬中心由等摩爾Ｚｎ２＋和Ｃｄ２＋組成［１２６，??１２７］??〇??ＭＰＤ雙核金屬ｏ／ｐ與Ｄ２５５側(cè)鏈羧基和一個(gè)橋接氫氧根配位連接，周圍是組氨酸富集區(qū)，??分布有?Ｈ２３４、Ｈ１４７、Ｈ１４９、Ｈ１５２、Ｈ３０２?和?Ｄ１５１。ａ?金屬由?Ｈ１５２，?Ｈ３０２?和?Ｄ１５１?穩(wěn)定，呈八??面體結(jié)構(gòu)；Ｐ金屬也是八面體結(jié)構(gòu)，由Ｈ１４７、Ｈ１４９、Ｈ２３４和兩個(gè)橋接配位體穩(wěn)定（圖１．６Ｂ）??［１２８１。ＭＰＤ活性部位和ＰＴＥ有相似結(jié)構(gòu)的疏水口袋．？離去基團(tuán)口袋由Ｆ１Ｉ９，?Ｗ１７９和Ｆ１９６組??成

博士學(xué)位論文??ＤＯＣＴＯＲＡＬ?ＤＩＳＳＥＲＴＡＴＩＯＮ??源二聚體組成［１°３’?１３ｅｉ？每個(gè)亞基包含球狀的Ｎ端結(jié)構(gòu)域和ｐｉｔａ－ｂｒｅａｄ折疊狀的Ｃ端結(jié)構(gòu)域（圖??１．７Ａ）［１Ｑ３］。雙核金屬Ｍｎ２＋位于Ｃ端結(jié)構(gòu)域中心，Ａ金屬配位連接Ｈ３３６和Ｅ３８１；?Ｂ金屬與Ｄ２４４??形成兩個(gè)配位鍵；Ｅ４２０和Ｄ２５５參與穩(wěn)定金屬中心（圖１．７Ｂ）?［１Ｍ］。ＯＰＡＡ／產(chǎn)物復(fù)合物結(jié)構(gòu)顯??示金屬中心橋接氧原子，據(jù)此推測(cè)游離酶在水溶劑中存在金屬輔因子橋接氫氧根的狀態(tài)；ＡＭＰＰ??結(jié)構(gòu)的確顯示出金屬位點(diǎn)同氫氧根形成氧橋［１３１］。ＯＰＡＡ底物結(jié)合部位也有三個(gè)口袋：大小口袋??和離去基團(tuán)口袋（圖１．７Ｃ）?［１Ｑ３］。小口袋由Ｙ２１２、Ｖ３４２和Ｈ３４３組成；大口袋由Ｌ２２５、Ｈ２２６、??Ｈ３３２和Ｒ４１８組成；它們共同負(fù)責(zé)結(jié)合底物。ＯＰＡＡ離去基團(tuán)口袋由Ｆ２９２和Ｌ３６６構(gòu)成，偏愛??體積較小的基團(tuán)，如氟離子。??
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