在大氣中廣泛存在的超細(xì)顆粒物是一種典型的納米級(jí)顆粒物,它們主要來(lái)自工業(yè)廢氣和汽車尾氣的排放、人工合成以及自然活動(dòng)。超細(xì)顆粒物對(duì)人體的暴露主要發(fā)生于空氣污染嚴(yán)重的生活區(qū)域以及與超細(xì)顆粒物相關(guān)的生產(chǎn)活動(dòng)中。超細(xì)顆粒物對(duì)生物體的暴露可以引發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)以及呼吸道疾病,并且可以穿過(guò)肺泡進(jìn)入血液循環(huán)并最終導(dǎo)致其他器官的炎癥反應(yīng)。作為一種主要由人工合成并被廣泛應(yīng)用的超細(xì)顆粒物,超細(xì)炭黑被廣泛地應(yīng)用于印染、橡膠合成、噴漆、印刷等行業(yè)�；谝陨显�,超細(xì)炭黑對(duì)人體潛在的毒性危害越發(fā)受到人們重視,其毒性的研究也被廣泛開(kāi)展。超細(xì)炭黑是一種炭基的超細(xì)顆粒物,其粒徑一般小于100 nm,本文中研究的兩種超細(xì)炭黑粒徑分別為13nm和50nm,根據(jù)這兩種炭黑在不同分散體系中的溶解度差異,我們將其分別用于細(xì)胞毒理學(xué)和分子與動(dòng)物毒理學(xué)的研究中�，F(xiàn)有的研究表明超細(xì)炭黑可以誘發(fā)小鼠的呼吸道疾病并對(duì)小鼠的肺產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷,然而超細(xì)炭黑可以通過(guò)進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)對(duì)生物體內(nèi)的細(xì)胞和生物大分子造成損傷,目前關(guān)于超細(xì)炭黑在細(xì)胞和分子水平上的毒性研究尚未有報(bào)道;此外,目前研究超細(xì)炭黑的模型動(dòng)物大都是哺乳動(dòng)物,由于超細(xì)炭黑被廣泛用于土壤和水的治理以及農(nóng)業(yè)中,超細(xì)炭黑進(jìn)入水環(huán)境的概率大幅上升,然而很少有文獻(xiàn)報(bào)道超細(xì)炭黑對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)。因此,我們?cè)诜肿�、�?xì)胞以及動(dòng)物水平上系統(tǒng)研究了超細(xì)炭黑對(duì)抗氧化酶、DNA、小鼠原代肝細(xì)胞以及斑馬魚(yú)的氧化應(yīng)激毒性和基因毒性的機(jī)理。研究的內(nèi)容主要分為以下六個(gè)部分:第一章主要評(píng)述了超細(xì)顆粒物在環(huán)境中的廣泛分布、超細(xì)顆粒物對(duì)人體健康的危害、超細(xì)顆粒物進(jìn)入生物體后與生物大分子結(jié)合形成蛋白冠的機(jī)理以及生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)對(duì)超細(xì)顆粒物在生物體內(nèi)分布和其毒性效應(yīng)的影響;解釋了超細(xì)顆粒物在生物體內(nèi)和細(xì)胞內(nèi)誘發(fā)氧化應(yīng)激的機(jī)理,并引出了超細(xì)炭黑與超細(xì)顆粒物的關(guān)系;最后歸納了超細(xì)炭黑在人們生產(chǎn)生活中的廣泛應(yīng)用,及對(duì)人體可能產(chǎn)生的潛在危害。通過(guò)整理和總結(jié)目前對(duì)超細(xì)炭黑的毒性的研究,發(fā)現(xiàn)了待急需解決的問(wèn)題,并針對(duì)這些問(wèn)題制定了自己的研究方案。第二章主要對(duì)兩種超細(xì)炭黑在不同分散劑中的分散效果進(jìn)行了表征,選出最佳的分散體系用于對(duì)應(yīng)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)的研究。本部分實(shí)驗(yàn)通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射、掃描電鏡、透射電鏡實(shí)驗(yàn)研究了五種不同分散劑(超純水、吐溫80、吐溫20、100%乙醇溶液、完全培養(yǎng)基)對(duì)FW200和SB100這兩種超細(xì)炭黑的分散效果。動(dòng)態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明FW200和SB100均可以很好地在無(wú)水乙醇以及吐溫20和吐溫80這兩種常用的非離子型分散劑中被分散開(kāi)。此外,FW200在完全培養(yǎng)基中表現(xiàn)出較好的分散性,其在完全培養(yǎng)基中的分散效果優(yōu)于SB100。另一方面,SB100在超純水中分散效果明顯優(yōu)于FW200。因此,我們選用完全培養(yǎng)基作為FW200在細(xì)胞毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中的分散劑,超純水作為SB100在分子和動(dòng)物毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中的分散劑。第三章我們通過(guò)研究超細(xì)炭黑與抗氧化酶和DNA分子的相互作用揭示了超細(xì)炭黑在分子水平上對(duì)生物體可能誘發(fā)氧化應(yīng)激和基因毒性的機(jī)理�？寡趸鞍自谏矬w中起著消除活性氧物質(zhì)(ROS)的重要作用,外源物質(zhì)可以通過(guò)進(jìn)入生物體破壞抗氧化蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)而誘發(fā)生物體內(nèi)氧化應(yīng)激的發(fā)生;研究超細(xì)炭黑與DNA分子的作用可以在分子層面揭示超細(xì)炭黑的基因毒性。因此為了在分子層面揭示超細(xì)炭黑誘發(fā)氧化應(yīng)激和基因毒性的機(jī)理,我們采用紫外吸收光譜、穩(wěn)態(tài)熒光光譜、同步熒光光譜、三維熒光、共振光散射、圓二色譜研究了超細(xì)炭黑與抗氧化酶和鯡魚(yú)精子DNA(簡(jiǎn)稱DNA)相互作用的機(jī)理;其次我們通過(guò)酶活性試驗(yàn)研究了超細(xì)炭黑對(duì)抗氧化酶的酶活力的改變;最后我們根據(jù)光譜學(xué)以及酶活性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果建立了超細(xì)炭黑與抗氧化酶和DNA分子相互結(jié)合的模型以更加形象地解釋二者相互作用以及結(jié)合的模式。本章總共分為四個(gè)部分,分別是超細(xì)炭黑對(duì)超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LYZ)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF)和DNA的分子毒性分析。(1)超細(xì)炭黑對(duì)SOD的分子毒性機(jī)理。超細(xì)炭黑與SOD相互作用導(dǎo)致了SOD結(jié)構(gòu)和活力的改變。三維熒光的結(jié)果表明超細(xì)炭黑在和SOD結(jié)合后形成了一種被稱為“蛋白冠”的復(fù)合物,并且使體系的粒徑增大;穩(wěn)態(tài)熒光和紫外吸收光譜的結(jié)果表明超細(xì)炭黑與SOD的結(jié)合使SOD的內(nèi)源熒光發(fā)生猝滅,并導(dǎo)致了SOD的骨架更加松散,同時(shí)導(dǎo)致SOD的微環(huán)境疏水性減弱極性增強(qiáng);我們進(jìn)一步通過(guò)研究超細(xì)炭黑對(duì)SOD圓二色譜的影響發(fā)現(xiàn)超細(xì)炭黑顯著地改變了 SOD的二級(jí)結(jié)構(gòu)使其二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-helix的含量增加β-sheet的含量降低;酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示超細(xì)炭黑可以在一定程度上抑制SOD的酶活力。我們?cè)谝陨蠈?shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上建立了超細(xì)炭黑與SOD結(jié)合的分子模型,從模型中可以看出超細(xì)炭黑可能通過(guò)疏水力結(jié)合在了 SOD的底物通道以及α-helix結(jié)構(gòu)附近,這可能導(dǎo)致其底物通道的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變最終導(dǎo)致酶活性的降低,這種結(jié)合模式可以有力的解釋超細(xì)炭黑對(duì)SOD的二級(jí)結(jié)構(gòu)和酶活力的改變機(jī)理。(2)超細(xì)炭黑對(duì)LYZ的分子毒性機(jī)理。超細(xì)炭黑對(duì)LYZ的影響與對(duì)SOD的影響相似,也改變了 LYZ的結(jié)構(gòu)和活力。超細(xì)炭黑與LYZ的結(jié)合導(dǎo)致超細(xì)炭黑-LYZ體系粒徑增大;紫外吸收光譜的實(shí)驗(yàn)顯示超細(xì)炭黑改變了 LYZ的碳骨架結(jié)構(gòu)并使其發(fā)生去折疊現(xiàn)象,同時(shí)也改變了氨基酸之間羰基(C=O)的π→π*電子轉(zhuǎn)移;熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示超細(xì)炭黑猝滅了 LYZ的內(nèi)源熒光,改變了 LYZ內(nèi)生色團(tuán)的微環(huán)境,但并沒(méi)有顯著改變其內(nèi)部環(huán)境的疏水性;圓二色譜的結(jié)果顯示超細(xì)炭黑對(duì)LYZ的二級(jí)結(jié)構(gòu)同樣產(chǎn)生了影響,導(dǎo)致α-helix含量增加1 1%;酶活的實(shí)驗(yàn)顯示超細(xì)炭黑對(duì)LYZ的酶活力產(chǎn)生了顯著地抑制作用:隨后根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果建立了二者結(jié)合的模型,模型顯示超細(xì)炭黑可能通過(guò)疏水力的形式結(jié)合在LYZ的酶活性中心的Trp62、Trp63、Trp108三種氨基酸殘基附近。(3)超細(xì)炭黑對(duì)TF的分子毒性機(jī)理。超細(xì)炭黑與TF的相互作用機(jī)理與前兩種蛋白有一定程度的不同。超細(xì)炭黑與TF的結(jié)合使TF的內(nèi)源熒光強(qiáng)度升高,說(shuō)明超細(xì)炭黑對(duì)TF結(jié)構(gòu)的改變可能導(dǎo)致了 TF內(nèi)生色團(tuán)周圍的猝滅基團(tuán)如羰基基團(tuán)與生色團(tuán)的距離增大,超細(xì)炭黑也改變了 TF的碳骨架使其去折疊化并影響了 TF的二級(jí)結(jié)構(gòu)使α-helix含量減少而β-sheet的含量增加,但是超細(xì)炭黑并沒(méi)有對(duì)TF的疏水性產(chǎn)生顯著影響,說(shuō)明疏水力不是二者之間結(jié)合的主要作用力。最后,我們通過(guò)建立兩者之間相互作用的模型更加形象地展示了超細(xì)炭黑通過(guò)結(jié)合在TF的α-helix結(jié)構(gòu)上與TF發(fā)生相互作用的分子機(jī)理。(4)超細(xì)炭黑在分子水平的基因毒性。超細(xì)炭黑通過(guò)靜電結(jié)合的方式與DNA發(fā)生作用,導(dǎo)致DNA的磷酸骨架以及含氮堿基等結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,此外,超細(xì)炭黑也對(duì)DNA的右手螺旋性產(chǎn)生了輕微的影響。第四章以小鼠原代肝細(xì)胞為研究對(duì)象,通過(guò)將超細(xì)炭黑對(duì)小鼠原代肝細(xì)胞進(jìn)行體外暴露揭示了超細(xì)炭黑在細(xì)胞水平上對(duì)小鼠原代肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激以及基因毒性效應(yīng)。經(jīng)過(guò)24小時(shí)暴露,超細(xì)炭黑誘發(fā)了小鼠原代肝細(xì)胞內(nèi)ROS(活性氧類物質(zhì))的升高,并刺激了細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫酶活力的升高以及還原型谷胱甘肽含量的降低,超細(xì)炭黑同時(shí)也誘發(fā)了細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的發(fā)生,導(dǎo)致MDA水平的升高,這一過(guò)程最終導(dǎo)致了小鼠原代肝細(xì)胞的細(xì)胞活力下降,凋亡水平升高以及顯著的基因損傷。第五章主要研究了超細(xì)炭黑在動(dòng)物水平上對(duì)斑馬魚(yú)造成的毒性影響。通過(guò)將一定量的超細(xì)炭黑溶液直接注射到斑馬魚(yú)幼魚(yú)的卵黃中來(lái)模擬超細(xì)炭黑從母體到幼體的遺傳暴露。我們?cè)谧⑸浜蟛煌臅r(shí)間點(diǎn)檢測(cè)了斑馬魚(yú)多個(gè)身體指標(biāo)的變化從而在動(dòng)物水平上闡釋了超細(xì)炭黑誘發(fā)氧化應(yīng)激以及基因毒性的機(jī)理。我們發(fā)現(xiàn)超細(xì)炭黑可以顯著抑制斑馬魚(yú)的生長(zhǎng)發(fā)育并導(dǎo)致斑馬魚(yú)死亡率和畸形率的升高;基因表達(dá)水平測(cè)試結(jié)果發(fā)現(xiàn)超細(xì)炭黑引起了斑馬魚(yú)抗氧化基因sod1/sod2的升高,視覺(jué)(opn1lw2,opon1mw1,opn1sw2)與神經(jīng)系統(tǒng)(gfap,mbp,syn2a)相關(guān)基因表達(dá)水平的降低,說(shuō)明超細(xì)炭黑導(dǎo)致斑馬魚(yú)體內(nèi)氧化還原平衡的紊亂,影響了斑馬魚(yú)視覺(jué)以及神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育;進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)超細(xì)炭黑顯著抑制了斑馬魚(yú)的運(yùn)動(dòng)活力導(dǎo)致其行為異常。以上的研究表明超細(xì)炭黑通過(guò)誘發(fā)氧化應(yīng)激導(dǎo)致了斑馬魚(yú)基因表達(dá)水平的變化以及生長(zhǎng)發(fā)育的異常。第六章對(duì)全論文的研究?jī)?nèi)容進(jìn)行了歸納總結(jié),概括了論文的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)和意義,在對(duì)全文的研究?jī)?nèi)容進(jìn)行系統(tǒng)總結(jié)的基礎(chǔ)上分析了研究的不足和未來(lái)研究展望。本研究以抗氧化蛋白、DNA分子、小鼠原代肝細(xì)胞以及斑馬魚(yú)為研究對(duì)象,系統(tǒng)地研究了超細(xì)炭黑在分子、細(xì)胞以及動(dòng)物水平上的毒性效應(yīng),總結(jié)了超細(xì)炭黑對(duì)三種抗氧化蛋白的結(jié)構(gòu)和功能造成影響的機(jī)制,發(fā)現(xiàn)了超細(xì)炭黑進(jìn)入小鼠原代肝細(xì)胞內(nèi)部并誘發(fā)細(xì)胞的氧化應(yīng)激和基因損傷,在動(dòng)物水平上證明了超細(xì)炭黑可以通過(guò)誘發(fā)斑馬魚(yú)氧化應(yīng)激效應(yīng)對(duì)斑馬魚(yú)的基因表達(dá)水平和生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響。本論文系統(tǒng)闡述了超細(xì)炭黑在分子、細(xì)胞以及動(dòng)物水平上誘發(fā)氧化應(yīng)激和基因毒性的機(jī)理,有助于人們從三個(gè)不同層次了解超細(xì)炭黑的毒性和環(huán)境健康效應(yīng),為未來(lái)進(jìn)一步研究超細(xì)炭黑的毒性效應(yīng)和評(píng)估超細(xì)顆粒物的潛在危害以及國(guó)家制定相關(guān)政策方針管理超細(xì)顆粒的排放提供參考。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：X171.5
【部分圖文】：

??圍的超細(xì)炭黑分散液，然后對(duì)過(guò)濾后的分散溶液進(jìn)行了水合粒徑的測(cè)量。如圖２－??２，通過(guò)０．２和０．８?的濾膜過(guò)濾后，我們得到了分布在３５和１００?ｎｍ左右的??超細(xì)炭黑，這一結(jié)果說(shuō)明了大粒徑的超細(xì)炭黑對(duì)小粒徑的超細(xì)炭黑的動(dòng)態(tài)光散射??信號(hào)的干擾和阻擋，證明了在超細(xì)炭黑分散體系中不同粒徑的超細(xì)炭黑顆粒的分??布。Ｂｏｕｒｄｏｎ等人在對(duì)分散于小鼠支氣管灌洗液中的超細(xì)炭黑進(jìn)行過(guò)濾并表征后??同樣發(fā)現(xiàn)了這一小顆粒被較大顆粒的超細(xì)炭黑遮擋的現(xiàn)象［７２］。對(duì)于未過(guò)濾的超??細(xì)炭黑溶液以及通過(guò)０．８?ｐｍ濾膜過(guò)濾的溶液，我們發(fā)現(xiàn)在５５００?ｎｍ出同樣出現(xiàn)??了一個(gè)極微弱散射峰，這表明在這兩種炭黑溶液中存在著極少的雜質(zhì)和聚合程度??較高的炭黑聚合物。在經(jīng)過(guò)０．２?ｐｍ的濾膜過(guò)濾后的炭黑溶液沒(méi)有第二個(gè)散射峰，??說(shuō)明經(jīng)過(guò)更細(xì)的濾膜過(guò)濾后的炭黑溶液均一性更高。??３０?１?—Ｎ＜＿＞御齡??４??Ｎ?（ＦＷ２００）?－?０．８?ｐｍ?ｆｉｌｔｅｒ??２５?（??Ｎ?｛ＦＷ２００）?－?ｒａｗ??１?Ｉａ，??１?１０?１００?１０００?１００００??Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ?Ｄｉａｍｅｔｅｒ，?ｄｊ＿｜?（ｎｍ）??圖２－２未過(guò)濾的ＦＷ２００?（ｒａｗ）以及通過(guò)０．８叫１和０．２?ｐｍ膜過(guò)濾后的ＦＷ２００??在完全培養(yǎng)基中的粒徑分布圖。實(shí)驗(yàn)條件：ＣＲＶ２〇ｏ＝５〇ｎｇｍＬ＿１。??Ｆｉｇ．?２－２．?Ｄｙｎａｍｉｃ?ｌｉｇｈｔ?ｓｃ

蛋白質(zhì)的主要熒光來(lái)自其色氨酸激發(fā)產(chǎn)生的內(nèi)源熒光。然而，ＳＯＤ蛋白質(zhì)內(nèi)部缺??失了色氨酸，只有酪氨酸和苯丙氨酸，因此我們此次熒光實(shí)驗(yàn)主要檢測(cè)了ＳＯＤ內(nèi)??酪氨酸和苯丙氨酸所發(fā)的熒光。從圖３－２可以看出隨著ＳＢ１００濃度的升高，ＳＯＤ的??內(nèi)源熒光發(fā)生了明顯的猝滅，這說(shuō)明ＳＢ１００與ＳＯＤ發(fā)生了相互作用，這種相互作??用改變了?ＳＯＤ的酪氨酸和苯丙氨酸周圍的微環(huán)境以及ＳＯＤ的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。??３１??

三維熒光光譜可以同時(shí)表示出激發(fā)和發(fā)射熒光的波長(zhǎng)位置，同時(shí)還可以??以ｚ軸表示發(fā)射光的熒光強(qiáng)度，因此對(duì)蛋白質(zhì)等生物大分子的熒光信息的表示更??加豐富。蛋白質(zhì)的三維熒光通常有４個(gè)峰（圖３－３Ａ），其中１號(hào)峰和２號(hào)峰代表的??是生色團(tuán)的周圍微環(huán)境的信息，外側(cè)的兩個(gè)是瑞利散射峰，指的是當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)等??于發(fā)射波長(zhǎng)時(shí)所產(chǎn)生的共振光的熒光峰，瑞利散射峰代表的是所測(cè)體系中顆粒的??大小。如圖３－３所示，當(dāng)ＳＢ１００濃度為５〇ｎｇｍＩ／ｉ時(shí)，ＳＯＤ的１號(hào)峰和２號(hào)峰峰強(qiáng)度??均有明顯下降，說(shuō)明ＳＢ１００與ＳＯＤ的相互作用導(dǎo)致ＳＯＤ內(nèi)生色團(tuán)微環(huán)境發(fā)生了明??顯變化，影響了?ＳＯＤ的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。而瑞利散射峰的顯著升高一方面是由ＳＢ１００??３２??

本文編號(hào)：2856736