湖泊富營養(yǎng)化和藍藻水華頻繁爆發(fā)是當前國內外迫切關注的環(huán)境問題,其主要危害之一是微囊藻毒素(Microcystins,MCs)的產生。大量研究表明,MCs不但是典型的肝毒素,還具有明顯的生殖毒性,可對魚類的生長發(fā)育產生不利影響。為了系統(tǒng)地評估MCs對魚類生殖和生長發(fā)育的毒性效應,本研究選取模式生物斑馬魚(Danio rerio)作為實驗材料,首先在急性毒性實驗中研究了腹腔注射MC-LR后斑馬魚卵巢的病理損傷及抗氧化系統(tǒng)響應的時間劑量效應規(guī)律;進一步采用生命周期暴露,從生長參數、超微組織病理學損傷、性激素含量及調控通路上關鍵基因表達水平幾方面,系統(tǒng)分析了環(huán)境相關劑量下MC-LR對斑馬魚生長、生殖內分泌系統(tǒng)的干擾效應;最后,通過亞慢性暴露實驗,從精巢組織學、性激素含量、相關基因和蛋白表達多個層面,全面地評估了MC-LR對成年雄性斑馬魚生殖內分泌系統(tǒng)的毒性影響和干擾作用,并對其雌激素效應潛力及產生機制進行了合理的推斷。本研究的開展為全面系統(tǒng)地認識MC-LR的生長和生殖毒性、內分泌干擾效應及評估自然條件下MC-LR雌激素效應風險提供了重要的實驗依據。主要結果如下:1.在急性毒性實驗中,以雌性斑馬魚為研究對象,腹腔注射50和200μg/kg BW劑量的MC-LR,分別在注射后1、3、12、24、48、168 h后取樣,研究結果顯示:卵巢病理變化在注射后12 h內呈時間依賴性增長,主要表現為空泡化、細胞間隙擴大和細胞溶解;同時MDA含量顯著升高,伴隨著抗氧化酶CAT、SOD、GPx活性及基因表達不同程度的增加,表明氧化脅迫在MC-LR引起的生殖毒性中起著重要作用;卵巢中GSH的大量消耗暗示GSH解毒途徑可能在MC-LR解毒中發(fā)揮著關鍵作用;168 h后卵巢病理損傷和抗氧化機能的恢復,表明組織中抗氧化防御系統(tǒng)的響應是緩解MC-LR毒性影響的重要機制之一。2.在生命周期實驗中,斑馬魚從幼魚階段(5 d)開始暴露于0、0.3、3和30μg/L MC-LR 90 d至性成熟。結果表明:環(huán)境劑量(大于3μg/L)的MC-LR可導致生長受阻,腦、肝臟病理學損傷,性腺發(fā)育遲緩;MC-LR對生長發(fā)育的抑制效應可能是通過下調GH/IGF軸上游ghrh、pacap1、gh,以及性腺中ghra、igf3、igf2r(雌魚和雄魚)和igf1(僅雄魚)基因表達造成的,并表現出一定的雌雄差異性;3和30μg/L濃度下,卵巢T含量顯著下降,而E2含量仍保持穩(wěn)定,結合HPGL軸基因表達結果推測,性激素變化可能由于卵巢發(fā)育遲緩引發(fā)機體負反饋調節(jié),導致腦中上游基因fshβ和lhβ上調發(fā)揮補償效應,促進下游性腺中T向E2的轉化增加。進一步研究結果顯示,各處理組雌魚肝臟vtg1基因表達和卵巢中VTG含量均顯著降低,表明MC-LR會減少雌性斑馬魚卵巢的卵黃儲積,進而影響卵母細胞的成熟及生殖功能。3.在亞慢性實驗中,將成年雄性斑馬魚暴露于0、0.3、1、3、10、30μg/L MC-LR30 d。研究發(fā)現:MC-LR暴露可引起斑馬魚GSI減小、精巢細胞間隙擴大、成熟精子比例降低;MC-LR還能干擾HPGL軸相關基因表達,造成腦中上游基因(gnrh2、gnrh3、cyp19b、erα、erβ、ar、fshβ和lhβ)普遍出現劑量依賴性下調;精巢中類固醇激素合成基因(star、cyp11a、cyp17、cyp19a和fshr)在3μg/L出現上調,但隨著濃度的繼續(xù)升高而有所回落;精巢中性激素E2和T同樣出現非劑量依賴性升高,在10μg/L濃度下達到高峰,該結果暗示MC-LR內分泌干擾效應可能是其雌激素效應和細胞毒性雙重特性的體現。此外,3、10和30μg/L MC-LR引起雄性斑馬魚肝臟vtg1基因表達上調,表明長期持續(xù)性的MC-LR暴露可能對雄性斑馬魚產生雌激素效應;HPGL軸基因表達和精巢性激素含量的相關性分析表明,精巢中E2和T的含量變化與腦和肝臟中基因表達及肝臟ER蛋白表達變化相關性較低,但與精巢類固醇激素合成相關基因表達顯著相關,推測MC-LR的雌激素效應可能是通過干擾類固醇激素的合成,而非ER途徑介導的。
【學位單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：X503.225;S917.4
【部分圖文】：

圖 1-1 MC-LR 的分子結構圖Fig. 1-1 Structure of MC-LR然環(huán)境中 MC-LR 為中性或者帶負電荷，由于極性的作用，它酮等溶劑，其在水中的溶解度大于 1 g/L（Rivasseau et al 1998）

圖 1-2 性類固醇激素合成通路及關鍵基因Fig. 1-2 Synthetic pathway of sex steroid hormones and related key genes如圖 1-2 所示，最初，膽固醇在類固醇激素合成急性調節(jié)蛋白（StAR）的作用

圖 2-1 RNA 提取的部分電泳圖Fig.2-1 An electrophoresis figure of RNA extraction RNA，用 PrimeScript RT Reagents 反轉錄試劑盒（
【參考文獻】

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本文編號：2851649