鎘污染的土壤以及生長在其上的作物給環(huán)境和人類健康造成了長期的潛在的威脅。因此了解和掌握通過土壤和食物途徑攝入人體中的鎘的生物可接受率,生物有效性和毒性是非常必要的。本研究的目的是利用兩種不同的土壤和生長在其上的兩種作物,建Caco-2細(xì)胞/HL-7702胞模型來評價鎘的生物有效性/毒性。通過土壤和作物的體外消化結(jié)合Caco-2/HL7702細(xì)胞模型來進(jìn)行試驗。通過兩種土壤(黃壤,石灰性土壤)中及其上生長的作物(水稻,大白菜)中的鎘可以引起人肝細(xì)胞(HL7702)產(chǎn)生毒害,我們確定了兩種土壤中及兩種作物中鎘的最低濃度。主要結(jié)果如下：一、本研究中,人腸癌細(xì)胞株Caco2和人正常肝細(xì)胞株HL7702分別用來進(jìn)行鎘的生物有效性和毒性試驗,并證實這兩株細(xì)胞可以作為體外細(xì)胞模型研究鎘在人體腸和肝中的積累和毒性作用。結(jié)果表明,鎘的吸收在兩株細(xì)胞中是以劑量依賴的方式增加的,并且在濃度為10 mgL-1時,它在Caco-2細(xì)胞中的吸收(720.15μgmg-1 cell protein)顯著的高于HL-7702細(xì)胞的(229.01 μgmg-1 cell protein) 。同時對兩株細(xì)胞進(jìn)行了時間-依賴和劑量-依賴的鎘的細(xì)胞毒性的檢測(LDH釋放和MTT試驗)。HL-7702細(xì)胞抗氧化酶和分化標(biāo)記物(SOD, GPX和AKP)的活性均高于Caco-2細(xì)胞的,盡管隨著鎘濃度的增加,這些酶的活性均是顯著下降的。結(jié)果表明,在超過了一定的鎘水平下,鎘抑制了體外細(xì)胞抗氧化酶的活性,并且HL-7702細(xì)胞對鎘比Caco-2細(xì)胞更敏感。然而鎘濃度小于0.5 mg L1時對兩株細(xì)胞沒有影響。二、污染的土壤被攝入同樣是鎘進(jìn)入人體的一個重要途徑,尤其是當(dāng)兒童不小心通過抓食進(jìn)入口中。本研究通過體外消化法結(jié)合Caco2/HL7702細(xì)胞模型,模擬進(jìn)行了攝取的土壤中的鎘在人體中的生物可接受率,生物有效性和毒性試驗。結(jié)果表明,鎘的生物可接受率在胃期(44.3 to89.8%)和在腸期(35.69 to 46.15%)是攝入的黃壤土的大于石灰性土壤的,相應(yīng)的數(shù)值分別為8.65%到56.81%和6.08%到27.30%。鎘的生物有效性同樣也是攝入的黃壤土(13.50-35.40%)的大于石灰性土壤的(3.5-10.76%)。毒性試驗發(fā)現(xiàn),當(dāng)鎘濃度大于0.78μg時,進(jìn)入人肝細(xì)胞的鎘會誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化脅迫并降低了肝細(xì)胞HL-7702中的抗氧化酶的活性。這些結(jié)果表明黃壤土鎘的攝入污染要大于石灰性土壤的。三、鎘由污染的土壤經(jīng)食物鏈污染谷物和蔬菜并危害人體健康,因此了解通過稻米途徑攝入人體中的鎘的生物可接受率,生物有效性和毒性是非常必要的。本研究利用體外消化法結(jié)合Caco2/HL7702細(xì)胞模型檢測鎘污染土壤上的稻米,評估了鎘在人體中的生物可接受率,生物有效性和毒性。發(fā)現(xiàn)鎘的生物可接受率(18.45-30.41%)和生物有效性(4.048.62%)在黃壤上生長的稻米顯著的高于在石灰性土壤上生長的,對應(yīng)的數(shù)值分別是6.89-11.43%和1.77-2.25%。毒性試驗表明加入6 mg kg-1鎘在黃壤中稻米便開始產(chǎn)生體外細(xì)胞毒害而在石灰性土壤上的稻米則沒有顯著的變化則是由于稻米中鎘的濃度較低。在酸性鎘污染的土壤中的作物更利于人體對鎘的攝入。因此,監(jiān)測稻米中鎘的濃度來最大程度的減輕對人體健康的危害是必要的。四、采用體外消化結(jié)合Caco2/HL7702細(xì)胞模型,利用生長在鎘污染土壤上的大白菜對人肝細(xì)胞產(chǎn)生毒性,進(jìn)行了鎘的最小吸收濃度的試驗。結(jié)果表明,鎘的生物可接受率在胃期生長在黃壤上的白菜(40.84%)和生長在石灰性土壤上的白菜(21.54%)顯著高于腸期的,相對應(yīng)的數(shù)值為21.2%和11.11%。Caco2細(xì)胞鎘的生物有效性是黃壤上的白菜(5.27%-14.66%)的高于石灰性土壤上的白菜(1.12%-9.64%)。此毒性試驗中一個重要的發(fā)現(xiàn)便是在黃壤和石灰性土壤上轉(zhuǎn)移到白菜中的鎘可以通過抑制抗氧化物酶(SOD, GPx)的活性,誘導(dǎo)HL-7702細(xì)胞中產(chǎn)生過氧化(MDA, H2O2)脅迫本研究揭示了生長在酸性土壤中(黃壤)的大白菜中的鎘削弱了HL-7702細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)在土壤鎘濃度為2,6,9 mg kg-1時,從而最終加劇了肝細(xì)胞的氧化脅迫,然而,對于石灰性土壤上的大白菜,氧化脅迫只發(fā)生在土壤鎘濃度為9mgkg1時。酸性鎘污染的土壤上生產(chǎn)的蔬菜可以成為人類鎘攝入的潛在毒害。因此,有必監(jiān)測鎘在葉菜類蔬菜中的濃度最大限度的減輕對人類的危害。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：X833;X820.4
【文章目錄】：
ACKNOWLEDGEMENTS
CONTENTS
LIST OF TABLES
LIST OF FIGURES
ABBREVIATIONS
ABSTRACT
摘要
CHAPTER 1 General Introduction and Review of Literature
    1.1 Cadmium in soil
    1.2 Cadmium in food
    1.3 Dietary intake of cadmium by human
    1.4 Bioaccessibility and bioavailability of Cd to human
        1.4.1 Small intestinal absorption of Cd
        1.4.2 Distribution of cadmium after absorption
    1.5 Cadmium induced toxicity in human liver
        1.5.1 Cellular defense systems and thiol status
        1.5.2 Enhancement of lipid peroxidation
        1.5.3 Cellular enzymes and cadmium
    1.6 Objectives of the study
CHAPTER 2 Impact Assessment of Cadmium Toxicity and its Bioavailability in Human Cell Lines （Caco-2 and HL-7702） 18
    2.1 Introduction
    2.2 Materials and methods
        2.2.1 Chemicals and reagents
        2.2.2 Preparation of Cd solutions
        2.2.3 Cell culture
        2.2.4 Cadmium uptake
        2.2.5 Cytotoxicity assays
            2.2.5.1 MTT assay
            2.2.5.2 LDH （Lactate Dehydrogenase） release
        2.2.6 Enzyme assays
            2.2.6.1 Glutathione peroxidase （GPx）
            2.2.6.2 Superoxide dismutase （SOD）
            2.2.6.3 Alkaline phosphatase （AKP）
        2.2.7 Protein assay
        2.2.8 Statistical analysis
    2.3 Results and discussion
        2.3.1 Cellular uptake
        2.3.2 Effect of cadmium on LDH release and mitochondrial activity （MTT）
        2.3.3 Effect of Cd on antioxidant enzymes activity
        2.3.4 Effect of Cd on differentiation marker enzyme （AKP）
CHAPTER 3 In Vitro Determination of Cadmium Bioaccessibility and Bioavailability in Contaminated Soils and its Subsequent Toxicity in Normal Human Liver （HL-7702） Cells
    3.1 Introduction
    3.2 Materials and methods
        3.2.1 Chemicals and reagents
        3.2.2 Soil collection and analysis
        3.2.3 Total Cd of soil samples
        3.2.4 Oral bioaccessibility of soil Cd
        3.2.5 Cell culture
        3.2.6 Cd bioavailability assays by Caco-2 cells
        3.2.7 Toxicity assays via normal human liver （HL-7702） cell
            3.2.7.1 Cytotoxicity test
2O₂） enzymes activities'>            3.2.7.2 Analysis of lipid peroxidation （MDA） and oxidant （H₂O₂） enzymes activities
            3.2.7.3 Measurements of antioxidant （SOD, GPx） enzymes activities
        3.2.8 Transmission electron microscopic studies
        3.2.9 Quality control of cadmium analysis
        3.2.10 Statistical analysis
    3.3 Results
        3.3.1 Physico-chemical properties of soil
        3.3.2 Cadmium bioaccessibility in soils
        3.3.3 Cadmium bioavailability in contaminated soils
        3.3.4 Cytotoxicity assays
2O₂） activity in HL-7702 cells'>        3.3.5 Effect of Cd on lipid peroxidation and hydrogen peroxide （H₂O₂） activity in HL-7702 cells
        3.3.6 Effect of Cd on antioxidant （SOD, GPx） activities in HL-7702 cells
        3.3.7 Ultrastructural changes in HL-7702 cells
    3.4 Discussion
CHAPTER 4 Uptake of Cadmium by Rice Grown on Contaminated Coils and its Bioavailability/Toxicity in Human Cell Lines （Caco-2/HL-7702）
    4.1 Introduction
    4.2 Materials and methods
        4.2.1 Chemicals and reagents
        4.2.2 Glass house experiment, sampling and analysis
            4.2.2.1 Soil collection, analysis and Cd spiking
            4.2.2.2 Glasshouse experiment
            4.2.2.3 Rice sample preparation
        4.2.3 Chemical analysis
            4.2.3.1 Total Cd in soil and rice grain
        4.2.4 Cadmium bioavailability and toxicity assay
            4.2.4.1 In vitro digestion of rice sample
            4.2.4.2 Cell culture
            4.2.4.3 Cadmium uptake experiment in Caco-2 cell
        4.2.5 Cadmium toxicity assays in HL-7702 cells
            4.2.5.1 Cytotoxicity assay
            4.2.5.2 Enzyme assays
        4.2.6 Transmission electron microscopy
        4.2.7 Quality control of cadmium analysis
        4.2.8 Statistical analysis
    4.3 Results
        4.3.1 Physico-chemical properties of soil
        4.3.2 Yields of rice grain
        4.3.3 Cd concentration in polished rice grain
        4.3.4 Bioaccessibility of Cd in polished rice grain
        4.3.5 Cd bioavailability of polished rice
        4.3.6 Effect of cadmium on cytotoxicity assays (LDH release and MTT viability assay
        4.3.7 Effect of cadmium on lipid peroxidation and enzymes （oxidant+antioxidant） activities in HL-7702 cells
        4.3.8 Effect of Cd stress on ultrastructural changes in HL-7702 cells
    4.4 Discussion
CHAPTER 5 In vitro Assessment of Cadmium bioavailability in Chinese Cabbage Grown on Different Soils and its Toxic Effects on Human Health
    5.1 Introduction
    5.2 Materials and methods
        5.2.1 Chemicals and reagents
        5.2.2 Ethics statement
        5.2.3 Soil collection and analysis
        5.2.4 Greenhouse experiment
        5.2.5 Total Cd of soil and plant
        5.2.6 Cadmium bioavailability and toxicity assays
            5.2.6.1 In vitro digestion
            5.2.6.2 Cell culture
            5.2.6.3 Cd uptake （retention and transport） by Caco-2 cells
        5.2.7 Cadmium toxicity assays by HL-7702 cells
        5.2.8 Cytotoxicity assays
            5.2.8.1 MTT assay
            5.2.8.2 LDH release
        5.2.9 Lipid peroxidation assay
        5.2.10 Antioxidant and oxidant enzymes assays
        5.2.11 Transmission electron microscopy
        5.2.12 Quality control of cadmium analysis
        5.2.13 Statistical analysis
    5.3 Results
        5.3.1 Characteristics of soils
        5.3.2 Accumulation of Cd in Chinese cabbage
        5.3.3 Bioaccessibility of Cd in Chinese cabbage shoots
        5.3.4 Bioavailability of Cd from Chinese cabbage
        5.3.5 Cd affected cell viability （MTT） and stability （LDH release） in HL-7702 cells
        5.3.6 Cd Induced lipid peroxidation （MDA） in HL-7702 cells
2O₂） enzyme activities in HL-702 cells 83'>        5.3.7 Effect of Cd on antioxidant （SOD, GPx） and oxidant （H₂O₂） enzyme activities in HL-702 cells 83
        5.3.8 Effects of Cd on morphological alterations in HL-7702 cells
    5.4 Discussion
CHAPTER 6 Conclusions and Future Recommendations
    6.1 Main conclusions
    6.2 Future perspectives
REFERENCES
LIST OF PUBLICATIONS

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本文編號：2845710