發(fā)布時間：2020-10-01 15:02

　　 四溴雙酚A(TBBPA)作為目前市場上使用量最大的溴代阻燃劑(BFRs),被廣泛應(yīng)用于電子/電器、運輸包裝、建材、家具和紡織品等領(lǐng)域。由于TBBPA在生產(chǎn)、使用和廢棄過程中都可以進入到環(huán)境中,而且目前已在不同的環(huán)境介質(zhì)如水體、沉積物、活性污泥、土壤、室內(nèi)灰塵、水生生物體甚至人體血清中均有檢出,并且對環(huán)境及生物體存在潛在危害,因此受到世界各國政府和科學(xué)家的廣泛關(guān)注。目前國內(nèi)外研究者在利用微生物降解BFRs方面做了大量的工作,主要包括對高效降解菌株分離、鑒定,溴代阻燃劑的脫溴和降解動力學(xué)和降解機理等的研究,但對微生物降解BFRs的生化和分子遺傳機制及其關(guān)鍵酶基因的克隆分析和應(yīng)用研究、基因工程菌的構(gòu)建等方面卻幾乎未見報道。本論文分別以能降解TBBPA和三溴苯酚(TBP)的菌種蒼白桿菌(Ochrobactrum sp.T)和芽孢桿菌(Bacillus sp.GZT)為研究對象,通過全基因組測序獲得兩株菌株的全基因組序列,并通過克隆和表達分別對能夠降解TBBPA和TBP的脫鹵酶及其編碼基因進行了考察。此外,利用超濾、鹽析、離子交換和凝膠層析等純化策略,也對野生菌株的脫鹵酶進行了純化研究和酶學(xué)性質(zhì)的考察,最后對脫鹵酶分別降解TBBPA和TBP過程中生成的中間產(chǎn)物進行了分析,提出和闡明了TBBPA和TBP生物降解的分子途徑和機理。主要的研究結(jié)果如下:(1)獲得了Ochrobactrum sp.T全基因組序列,并找到24個可能與鹵代化合物降解或者代謝相關(guān)的基因。進一步對這些基因進行克隆和表達篩選到了一個含有編碼TBBPA降解酶的基因的重組菌,將該基因命名為tbbpa,并發(fā)現(xiàn)該重組酶的氨基酸序列與鹵代酸脫鹵酶的序列相似性達到了100%。利用重組菌降解TBBPA的結(jié)果表明,其在最佳條件培養(yǎng)溫度30 ~oC和pH值為7.0下降解TBBPA 96 h時降解率和礦化率分別能達到100%和37.8%,均要高于同樣條件下野生菌對TBBPA的降解率和礦化率。同時,降解基因tbbpa能被底物TBBPA誘導(dǎo)表達。重組菌暴露在TBBPA 72 h后,tbbpa基因的表達水平升高了10倍。在TBBPA生物降解體系中,加入含溴共代謝底物TBP對重組菌降解TBBPA前期有一定的促進作用,而內(nèi)分泌干擾素雙酚A(BPA)的加入則抑制了重組菌對TBBPA降解。(2)通過對具有TBBPA降解功能的重組菌所表達的脫鹵酶進行鎳離子親和層析,獲得了一個純化了10.2倍,比酶活力從0.3增加到3.06 units/mg蛋白,經(jīng)過SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS分析確定該酶為溴酚脫鹵酶,分子量為117kDa。其酶學(xué)性質(zhì)為:最適溫度為30°C,pH值為6.5,K_m和V_(max)分別為26.6μM和0.133μM/min/mg。NADPH和甲基紫精的存在可以加速該脫鹵酶對TBBPA的降解,但Cu~(2+)、抗壞血酸、細胞色素C的加入對脫鹵酶有明顯的抑制作用。進一步研究表明該脫鹵酶具有很寬的底物譜,能轉(zhuǎn)化包括2,6-二溴苯酚(2,6-DBP)和TBP等一系列的溴代底物。最后根據(jù)所鑒定出的3個氧化中間產(chǎn)物提出了溴酚脫鹵酶降解TBBPA的機理,即在氧氣存在的條件下TBBPA首先被氧化形成4-丙烯基-2,6-二溴苯酚和2,6-DBP,隨后經(jīng)TBP轉(zhuǎn)化成4-溴苯酚(4-BP),最后降解生成二苯醚。(3)通過硫酸銨沉淀、陰離子交換層析和凝膠過濾等一系列的步驟從具有高效TBP降解功能的Bacillus sp.GZT菌中分離獲得了一個TBP的脫鹵酶。整個純化過程,回收率為28.6%,純化倍數(shù)為47倍,比活力從0.4增加到18.9U/mg。經(jīng)SDS-PAGE檢測純化酶已達電泳純分子量約為63.4 KDa。MALDI-TOF/TOF鑒定顯示該酶與寡肽ABC轉(zhuǎn)運寡肽結(jié)合蛋白(oligopeptide ABC transporter oligopeptide-binding protein)和多肽ABC轉(zhuǎn)運底物結(jié)合蛋白(peptide ABC transporter substrate-binding protein)具有很高的同源性。脫鹵酶在pH值為6.5,溫度為35 ~oC的最適條件下降解TBP 120 min后,降解率可達到80%;動力學(xué)考察結(jié)果表明該酶的K_m為78μM,V_(max)為0.65μM/min/mg,并對2-溴苯酚(2-BP),2,4-二溴苯酚(2,4-DBP)和2,6-DBP,3-溴苯酚(3-BP)和4-BP均有降解活性。將編碼脫鹵酶的基因克隆后在E.coli BL21(DE3)實現(xiàn)高效表達,獲得了重組的TBP脫鹵酶并驗證了脫鹵酶的基因。對脫鹵酶降解TBP的機理進行研究發(fā)現(xiàn),脫鹵酶首先在TBP的鄰位和對位上脫去一個溴原子分別生成2,4-DBP和2,6-DBP,緊接著二溴中間產(chǎn)物通過生成2-BP而被轉(zhuǎn)化生成苯甲酸和苯乙酸。這一降解路徑與Bacillus sp.GZT降解TBP的降解路徑類似,表明該脫鹵酶是細菌催化TBP降解主要的酶。(4)Bacillus sp.GZT全基因組測序結(jié)果表明,其基因組總長為5.18 Mb,約覆蓋基因組208倍,共含有21個與鹵代化合物或者酚類化合物的降解或者代謝相關(guān)的基因。將這些基因進行克隆和表達共鑒定了5株分別具有降解TBP、2,4-DBP、2-BP、苯酚和2,6-二溴-4-甲基酚功能的重組菌,并將相應(yīng)的外源編碼基因命名為tbpA、tbpB、tbpD、tbpE和tbpC,表達的相應(yīng)的重組酶命名為tbpA、tbpB、tbpD、tbpE和tbpC。利用重組酶對TBP進行降解研究表明,TBP最初的降解是由tbpA酶催化的,降解率可以達到98.8%。RT-qPCR實驗結(jié)果表明TBP降解過程中外源的降解基因tbpA、tbpB、tbpD、tbpE和tbpC能被底物誘導(dǎo)表達。同時根據(jù)鑒定出4個TBP降解中間產(chǎn)物以及外源基因在TBP降解過程中表達水平的變化,初步提出了TBP生物降解的分子機理可分為兩個路徑。首先tbpA可以催化TBP通過脫溴生成2,4-DBP(路徑I),或者甲基化作用形成2,6-二溴-4-甲基酚(路徑II)。隨后2,4-DBP在tbpB催化下轉(zhuǎn)化為2-BP。而2,6-二溴-4-甲基酚和2-BP進一步在tbpC和tbpD催化下脫溴會生成苯酚,最后苯酚在tbpC作用下生成CO_2和H_2O。
【學(xué)位單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：X592;X172
【部分圖文】：

第 1章 引言（C-X）的斷裂，鹵化物被降解，而鹵元素還原需要的電子可以通過臨近和末端的 FeS 簇傳遞給 Co。目前文獻報道還原脫鹵酶主要通過以下三種路徑將鹵化物進行消除，1）通過路徑 A 形成一個鈷胺素加合物；2）在路徑 B 中，CoI起到電子供體的作用，將電子轉(zhuǎn)移給鹵代化合物 2）形成鹵素-鈷胺素鍵（路徑 C）（如圖 1.2 所示）。

2 圖 1.2 還原脫鹵酶脫鹵的機理形成一個鈷胺素加合物；路徑 B，單電子轉(zhuǎn)移； 路徑 C，形成一個鹵素-鈷胺素鍵(Jugder et al., 2015)posed reaction mechanisms of reductive dehalogenases. The three main schemes featuring an organocobalt adduct (PathA), a single-elect(Path B), and a halogen-cobalt bond (Path C) are depicted

兩株高效降解菌在典型溴代阻燃劑降解過程中的若干分子機理研究(2) 利用一系列的純化方法對 Bacillus sp. GZT 降解 TBP 的酶進行了純化研究，并對酶學(xué)性質(zhì)進行了考察，并通過對編碼脫鹵酶的基因進行克隆和表達對實驗結(jié)果進行了驗證。具體思路見圖 1.4。(3) 對脫鹵酶分別降解 TBBPA 和 TBP 過程中生成的中間產(chǎn)物進行了分析，提出和闡明了 TBBPA 和 TBP 生物降解的分子途徑和機理。

本文編號：2831595