以�；呓z氨酸內(nèi)酯(N-acyl-homoserine lactone,AHL)作為信號分子的群體感應(yīng)(Quorum sensing,QS)系統(tǒng)在革蘭氏陰性細菌中分布最廣,也是目前研究最多的QS系統(tǒng)。已有的關(guān)于細菌QS的研究大多基于實驗室可培養(yǎng)的方法,且主要集中在QS系統(tǒng)對下游基因與菌群生理行為的調(diào)控方面。傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法的局限性加之目前缺乏AHL合成酶基因的通用引物,限制了我們對基于AHL的QS系統(tǒng)在生態(tài)環(huán)境中分布及多樣性的認識。本文首先設(shè)計了一對針對土壤中代表性細菌-根瘤菌科(Rhizobiacae)的AHL合成酶基因的通用引物,并將這對引物分別應(yīng)用于陸生與濕地植物根際微生物群落,發(fā)現(xiàn)不同植物根際所處生境對AHL合成酶基因的分布與多樣性有很大影響,其中環(huán)境因素尤其是O2很可能起著重要的影響作用。缺氧環(huán)境在自然界中普遍存在,然而自然環(huán)境中O2濃度的變化是如何影響細菌QS系統(tǒng)基因表達和信號分子合成的目前還不清楚。研究缺氧環(huán)境下細菌QS系統(tǒng)的變化可以為定向調(diào)控細菌下游生理行為,特別是與污染物修復(fù)相關(guān)的生理活動提供重要的環(huán)境因素依據(jù)。為了研究缺氧環(huán)境對細菌QS系統(tǒng)的影響,本文從獲取具有環(huán)境修復(fù)價值的研究對象出發(fā)進行了菌株的篩選,篩選標準是具有芳香烴降解潛力的AHL產(chǎn)生菌,得到如下結(jié)論:具有芳香烴降解與AHL合成雙重潛力的細菌在系統(tǒng)分類上具有高度多樣性,在被調(diào)查的688株P(guān)roteobacteria中,超過11%的細菌基因組中同時含有環(huán)羥化雙加氧酶(ringhydroxylatingdioxygenase,RHD)和AHL合成酶基因;利用富集篩選的方法,從海洋、濕地植物根際以及土壤等環(huán)境中篩選到10株既能降解菲或芘又能產(chǎn)AHL的細菌,其中6株屬于鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales),四株屬于根瘤菌目(Rhizobiales),而這兩類細菌在基因組搜索法得到的數(shù)據(jù)中同樣也是優(yōu)勢菌群。分別從以上優(yōu)勢菌群Rhizobiacae和Sphingomonads中選取了具有污染修復(fù)潛力的代表性菌株Ensifer adhaerens X097 和Novosphingobium pentaromnaicivorans US6-1作為研究對象,詳細表征了兩株菌的QS系統(tǒng),并分別以平板生物膜和靜置培養(yǎng)方式作為缺氧環(huán)境的代表,研究了缺氧環(huán)境對兩株細菌AHL合成酶基因表達與AHL合成的影響。得到的主要結(jié)論有:(1)在X097和US6-1中,兩種缺氧環(huán)境均促進了 AHL的合成與AHL合成酶基因的表達。(2)在X097中,位于質(zhì)粒上的ensIl和ensI2基因分別負責合成多種中短鏈的AHL,而染色體上ensI3負責合成一種長鏈的C14-HSL;通過SWISS-MODEL預(yù)測的AHL合成酶的三級結(jié)構(gòu)中,質(zhì)粒上的EnsI1和EnsI2的三級結(jié)構(gòu)更相似,說明質(zhì)粒和染色體上的AHL合成酶在系統(tǒng)進化、產(chǎn)物合成以及蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)三個方面都顯示出很大差異;在缺氧環(huán)境下,X097合成的AHL信號分子的種類更多,AHL合成酶基因表達量更高,而且質(zhì)粒上的AHL合成酶基因比染色體上的對缺氧環(huán)境的響應(yīng)更敏感。(3)US6-1基因組中含有一對novI/novR,當分別敲除ovI或novR后,US6-1均不再合成AHL;US6-1靜置培養(yǎng)合成的、以及外源添加的AHL都會在生長期后期被US6-1當作碳、氮源利用,說明US6-1兼具AHL合成和淬滅的能力;US6-1在振蕩培養(yǎng)條件下不能合成AHL,而在靜置培養(yǎng)條件下可以合成多種AHL,其機制在于有氧環(huán)境下novI只有很低水平的轉(zhuǎn)錄,缺氧環(huán)境則促進了novI的轉(zhuǎn)錄和表達,而novR的表達在兩種環(huán)境下沒有顯著性差異;(4)探究了兩類 O2 響應(yīng)因子 fnr(fumarate nitrate regulator)和hk(histidine kinase)基因敲除對US6-1合成A1HL的影響,發(fā)現(xiàn)缺氧環(huán)境下單個fnr的敲除對AHL合成基本無影響,同時敲除任意兩個fnr均會提高AHL的產(chǎn)量,同時敲除三個fnr減慢了 AHL的降解速率。位于質(zhì)粒上的hk3的敲除對AHL合成的影響很小,染色體上的hk1或hk2的敲除雖使AHL的合成提前卻降低了 AHL的產(chǎn)量,基因敲除實驗的結(jié)果共同表明,多個氧氣響應(yīng)因子介導(dǎo)了菌株US6-1的QS系統(tǒng)對缺氧環(huán)境的響應(yīng);(5)根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)預(yù)測到脂肪酸合成途徑中的兩個關(guān)鍵基因fabZ和fabK在缺氧環(huán)境下可能會影響US6-1合成AHL;缺氧環(huán)境下由于novI基因表達量的變化會導(dǎo)致很多下游基因的表達量出現(xiàn)顯著性變化,包括一系列與環(huán)境應(yīng)激相關(guān)的基因,如金屬銅和亞碲酸鹽礦物耐受基因,以及可能參與PAHs、苯甲酸、氨基苯甲酸酯,阿特拉津等降解代謝的基因等。(6)比較了靜置培養(yǎng)條件下菌株US6-1與novI缺失突變株的菲降解率,發(fā)現(xiàn)缺氧脅迫下AHL合成酶基因的缺失顯著性降低了菌株US6-1對菲的降解率。
【學位單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：X172
【部分圖文】：

ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅｌａｃｔｏｎｅ，ＡＨＬ）作為信號分子，這類信號分子可以自由的透過細胞膜逡逑分泌到胞外；第二，ＡＨＬ可以被存在于內(nèi)膜或細胞質(zhì)中的特定受體蛋白（ＬｕｘＲ）逡逑所識別（圖１．１）；第三，Ｇ－細菌的ＱＳ系統(tǒng)一般可以調(diào)控支撐各種生物學過程的逡逑數(shù)十到上百個基因的表達；第四，ＡＨＬ的合成存在反饋機制，即ＡＨＬ的受體蛋逡逑白結(jié)合ＡＨＬ分子后會促進ＡＨＬ合成酶基因的表達，從而促進ＡＨＬ信號分子源逡逑源不斷的分泌與積累。逡逑0邋0邋Ｏ邋０逡逑ＡＨＬ邋0邐ＡＨＬ邋0邐0逡逑0邐°邋0邋°邋Ｏ邋Ｏ逡逑ｒ￣＼邐ｎ邋0邋＾邐＾逡逑0邋＾邋0邋0逡逑個邐ＬｕｘＲ邐ｆ邐0逡逑？邋ｗ邋ｐ邐d盛狻蟈義希戾澹蹋眨兀戾危裕幔櫻睿澹叔尾墳義希蹋錚麇澹穡錚穡酰歟幔簦椋錚鑠澹洌澹睿螅椋簦澹蒎危齲椋紓楨澹穡錚穡酰歟幔簦椋錚鑠澹洌澹睿螅椋簦義賢跡保備錮際弦跣韻婦粒齲絳藕歐腫詠櫚嫉模眩酉低常郟病藉義希疲椋玨澹保卞澹粒齲體澹恚澹洌椋幔簦澹溴澹眩渝澹螅螅

本文編號：2831319