多氯聯(lián)苯(PCBs)是一類人工合成的有機(jī)氯化合物,它具有優(yōu)良的物理化學(xué)性質(zhì),曾經(jīng)廣泛的應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。雖然PCBs已經(jīng)被禁止使用了近40年,但仍能在環(huán)境的各個(gè)角落檢測到它的存在。PCBs在環(huán)境中難降解,并具有生物蓄積性和高毒性,給生態(tài)環(huán)境和人類健康帶來了巨大的威脅。PCBs也因此成為各個(gè)國家和地區(qū)重點(diǎn)監(jiān)測的污染物之一。目前檢測PCBs的主要方法為氣相色譜法,但該方法對樣品前處理要求苛刻,所需儀器價(jià)格昂貴,檢測成本高,檢測周期長,不適合對樣品的快速高通量分析檢測。而免疫分析方法具有操作簡單、成本低、靈敏度高、能夠?qū)崿F(xiàn)對目標(biāo)分子的快速高通量分析檢測等優(yōu)點(diǎn),目前已廣泛的用于環(huán)境污染物的分析檢測。因此,建立快速簡便的免疫分析方法來檢測PCBs具有重要的意義和廣闊的應(yīng)用前景。本文制備了三種分別針對PCB12、PCB37和PCB77的多克隆抗體和一種抗PCB37的單克隆抗體,在此基礎(chǔ)上建立了檢測PCB12、PCB37、PCB77的間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法(ic-ELISA);將制備的抗體進(jìn)行生物素化處理,建立了檢測PCBs的生物素-親和素放大酶聯(lián)免疫吸附法(BA-ELISA);將不同的抗體和DNA修飾在金納米顆粒(GNPs)表面,制備了多種抗體-GNPs-DNA探針,用于取代傳統(tǒng)免疫PCR中的抗體-DNA結(jié)合物,基于這些探針,建立了基于實(shí)時(shí)熒光定量免疫PCR(rt-IPCR)的生物條形碼方法(BCA)來檢測環(huán)境中的PCBs。將這些方法用于實(shí)際環(huán)境樣品中PCBs的分析檢測,取得了滿意的結(jié)果,為實(shí)現(xiàn)快速、高通量分析檢測環(huán)境中的PCBs提供了可靠的技術(shù)支撐。主要研究結(jié)果如下:(1)以牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)為載體蛋白,分別用活化酯法和混合酸酐法制備了三種PCBs單體的人工免疫原和包被原,產(chǎn)物通過紫外光譜掃描分析確定半抗原與蛋白質(zhì)成功偶聯(lián);通過免疫新西蘭大白兔,制備了三種分別抗PCB12、抗PCB37和抗PCB77的多克隆抗體,所得的抗體特異性較好,效價(jià)較高,均能達(dá)到1:256000;本文還通過免疫小鼠,細(xì)胞融合,雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng),采集腹水,制備了抗PCB37單克隆抗體,和多克隆抗體相比,該抗體對PCB37的特異性更好。(2)利用所獲得的抗體,分別建立了檢測pcb12、pcb37和pcb77的ic-elisa方法。優(yōu)化了抗原抗體濃度,溫育時(shí)間,封閉液,有機(jī)溶劑,鹽離子強(qiáng)度,ph值等實(shí)驗(yàn)條件,在最佳實(shí)驗(yàn)條件下,分別建立了檢測pcb12、pcb37和pcb77的標(biāo)準(zhǔn)曲線;基于多克隆抗體,該方法對這三種pcbs單體的lod分別為0.016μgl-1、0.048μgl-1、0.063μgl-1。基于單克隆抗體,該方法對pcb37的lod為0.027μgl-1;將該方法用于海底沉積物樣品中pcbs的分析檢測,回收率均在81%-115%的范圍內(nèi),變異系數(shù)(cv)均小于15%。(3)將抗體進(jìn)行生物素化預(yù)處理,利用生物素-親和素生物系統(tǒng),分別建立了檢測pcb12、pcb37和pcb77的ba-elisa方法。優(yōu)化了包被原及生物素化抗體濃度,sa-hrp濃度,抗原抗體反應(yīng)時(shí)間,生物素化抗體與sa-hrp反應(yīng)時(shí)間等實(shí)驗(yàn)條件,同時(shí)還討論了有機(jī)溶劑濃度,反應(yīng)介質(zhì)中ph值及鹽離子濃度對實(shí)驗(yàn)的影響;在最佳實(shí)驗(yàn)條件下,分別建立了檢測pcb12、pcb37和pcb77的標(biāo)準(zhǔn)曲線;基于多克隆抗體,該方法檢測pcb12、pcb37和pcb77的ic50分別為0.53μgl-1,0.68μgl-1,1.36μgl-1;lod分別為4.5ngl-1、17ngl-1、18ngl-1;基于單克隆抗體,該方法檢測pcb37的ic50為0.27μgl-1,lod8ngl-1;將建立的方法用于帶魚樣品中pcbs的分析檢測,加標(biāo)樣品中pcb12、pcb37和pcb77的回收率均在81%-113%之間,cv均小于15%。(4)分別用羊抗兔igg、羊抗小鼠igg及dna修飾15nm的gnps,制備了羊抗兔igg-gnps-dna和羊抗小鼠igg-gnps-dna兩種gnps探針,用紫外掃描光譜和透射電鏡(tem)對其表征,確定抗體和dna修飾在gnps表面�；谶@兩種gnps探針,分別建立了檢測pcb12、pcb37、pcb77和aroclor1248的基于rt-ipcr的間接bca方法。該方法將包被原包被在戊二醛預(yù)處理過的pcr管上,讓其和樣品中的目標(biāo)分子競爭抗體,與包被原結(jié)合的抗體保留在pcr管內(nèi),然后通過抗體與gnps探針表面的二抗結(jié)合,使得部分gnps探針附著在pcr管內(nèi),其他gnps探針則通過洗滌去除,在實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增階段,條形碼dna從gnps探針表面釋放到pcr管內(nèi),并作為模板dna直接參與pcr擴(kuò)增,通過測定條形碼dna的量來間接檢測樣品中pcbs的含量。優(yōu)化了退火溫度,引物濃度,抗原抗體濃度,封閉液,gnps探針濃度,抗體與gnps探針反應(yīng)時(shí)間等實(shí)驗(yàn)條件;在最佳實(shí)驗(yàn)條件下,基于羊抗兔igg-gnps-dna探針和抗pcb12、抗pcb37、抗pcb77、抗aroclor1248四種多克隆抗體,分別建立了檢測pcb12、pcb37、pcb77、aroclor1248的標(biāo)準(zhǔn)曲線,其檢測下限分別為2.63pgl-1,4.35pgl-1,1.72pgl-1,10.20pgl-1�；谘蚩剐∈骾gg-gnps-dna探針和抗pcb37單克隆抗體,該方法檢測pcb37的lod為2.03pgl-1。將建立的方法用于小黃魚樣品中pcbs的分析檢測,加標(biāo)樣品的回收率均在81%-112%之間,cv均小于15%。(5)分別用不同的抗體和dna修飾15nm的gnps,制備了五種gnps探針,抗pcb12抗體-gnps-dna,抗pcb37多抗-gnps-dna,抗pcb37單抗-gnps-dna,抗pcb77抗體-gnps-dna和抗aroclor1248抗體-gnps-dna,分別用紫外掃描光譜和tem對其表征,確�？贵w和dna修飾在gnps表面;基于這五種gnps探針,分別建立了檢測pcb12、pcb37、pcb77和aroclor1248的基于rt-ipcr的直接競爭bca方法。該方法將包被原包被在戊二醛預(yù)處理過的pcr管上,讓其和樣品中的目標(biāo)分子競爭gnps探針上的抗體,一部分gnps通過包被原與抗體的特異性結(jié)合附著在pcr管內(nèi),其他gnps探針則通過洗滌去除,在實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增階段,條形碼dna從gnps探針表面釋放pcr管內(nèi),并作為模板dna直接參與pcr擴(kuò)增,通過測定條形碼dna的量來間接檢測樣品中pcbs的含量。優(yōu)化了金納米探針濃度,封閉液,抗原抗體反應(yīng)時(shí)間,有機(jī)溶劑濃度,反應(yīng)介質(zhì)中鹽離子強(qiáng)度,ph值等條件,并在最佳實(shí)驗(yàn)條件下,分別建立了檢測不同目標(biāo)分子的標(biāo)準(zhǔn)曲線。該方法檢測pcb12、pcb77、aroclor1248的檢測下限分別為4.36pgl-1,9.12pgl-1,2.55pgl-1;基于多克隆抗體和單克隆抗體,該方法檢測pcb37的檢測下限分別為4.64pgl-1,3.15pgl-1;將建立的方法用于帶魚樣品中pcbs的分析檢測,加標(biāo)樣品回收率均在81-110%之間,cv均小于15%�？傊�,本文建立了ic-elisa、ba-elisa、基于rt-ipcr的間接競爭bca和基于rt-ipcr的直接競爭bca四種免疫分析方法來檢測環(huán)境樣品中的pcbs,這四種方法操作簡便,快速,穩(wěn)定性好,靈敏度高,樣品檢測結(jié)果與gc-ecd具有較好的相關(guān)性,能夠用于實(shí)際環(huán)境樣品中pcbs的快速高通量分析檢測,具有較好的實(shí)際應(yīng)用前景。
【學(xué)位單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2014
【中圖分類】：X830
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞語
第一章 緒論
    1.1 多氯聯(lián)苯的概述
        1.1.1 多氯聯(lián)苯的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)
        1.1.2 多氯聯(lián)苯的來源
        1.1.3 多氯聯(lián)苯的危害
    1.2 多氯聯(lián)苯的檢測方法
        1.2.1 氣相色譜法
        1.2.2 光譜分析方法
        1.2.3 生物分析方法
        1.2.4 免疫分析方法
    1.3 生物條形碼技術(shù)概述
        1.3.1 生物條形碼技術(shù)的原理
        1.3.2 條形碼DNA
        1.3.3 納米粒子在生物條形碼技術(shù)中的應(yīng)用
        1.3.4 生物條形碼技術(shù)的發(fā)展
        1.3.5 生物條形碼技術(shù)的應(yīng)用
    1.4 研究對象
    1.5 研究目的及意義
    1.6 主要研究內(nèi)容及技術(shù)路線
        1.6.1 主要研究內(nèi)容
        1.6.2 技術(shù)路線
第二章 三種PCBs單體人工抗原及抗體的制備
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)儀器及材料
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑及材料
        2.2.3 試劑配制及材料預(yù)處理
    2.3 試驗(yàn)方法與步驟
        2.3.1 免疫原的制備
        2.3.2 包被原的制備
        2.3.3 人工抗原的鑒定
        2.3.4 人工抗原蛋白含量的測定
        2.3.5 偶聯(lián)物結(jié)合比的計(jì)算
        2.3.6 多克隆抗體的制備
        2.3.7 單克隆抗體的制備
        2.3.8 抗體效價(jià)測試
        2.3.9 抗體特異性分析
    2.4 結(jié)果與討論
        2.4.1 人工抗原的合成與表征
        2.4.2 人工抗原的蛋白含量及偶聯(lián)比
        2.4.3 多克隆抗體的制備及表征
        2.4.4 單克隆抗體的制備及表征
        2.4.5 抗體的特異性分析
    2.5 本章小結(jié)
第三章 ic-ELISA檢測PCBs方法的建立及應(yīng)用
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)儀器及材料
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑及材料
        3.2.3 試劑配制
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化
        3.3.2 間接競爭ELISA方法的建立
        3.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
        3.3.4 交叉反應(yīng)率分析
        3.3.5 樣品預(yù)處理及分析檢測
        3.3.6 回收率
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化
        3.4.2 方法的建立
        3.4.3 交叉反應(yīng)率
        3.4.4 樣品分析檢測
        3.4.5 回收率
    3.5 本章小結(jié)
第四章 BA-ELISA檢測PCBs方法的建立及應(yīng)用
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)儀器及材料
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑及材料
        4.2.3 試劑配制
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 生物素化抗體的制備
        4.3.2 BA-ELISA方法的建立
        4.3.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化
        4.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
        4.3.5 樣品預(yù)處理及分析檢測
        4.3.6 回收率
    4.4 結(jié)果與討論
        4.4.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化
        4.4.2 BA-ELISA方法的建立
        4.4.3 樣品的分析檢測
        4.4.4 回收率
    4.5 本章小結(jié)
第五章 基于rt-IPCR的間接競爭BCA方法檢測PCBs
    5.1 引言
    5.2 實(shí)驗(yàn)儀器及材料
        5.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        5.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑及材料
        5.2.3 寡核苷酸
        5.2.4 試劑配制
    5.3 實(shí)驗(yàn)方法
        5.3.1 寡核苷酸鏈及引物的設(shè)計(jì)
        5.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系
        5.3.3 金納米顆粒的制備及表征
        5.3.4 二抗的預(yù)處理
        5.3.5 金納米顆粒的修飾及表征
        5.3.6 間接競爭生物條形碼方法的基本步驟
        5.3.7 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化
        5.3.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
        5.3.9 樣品預(yù)處理及分析檢測
        5.3.10 回收率
    5.4 結(jié)果與討論
        5.4.1 PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化
        5.4.2 金納米顆粒的制備、修飾及表征
        5.4.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化
        5.4.4 間接競爭生物條形碼方法的建立
        5.4.5 樣品的分析檢測
        5.4.6 回收率
    5.5 本章小結(jié)
第六章 基于rt-IPCR的直接競爭BCA方法檢測PCBs
    6.1 引言
    6.2 實(shí)驗(yàn)儀器及材料
        6.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        6.2.2 實(shí)驗(yàn)材料
        6.2.3 寡核苷酸
        6.2.4 試劑配制
    6.3 實(shí)驗(yàn)方法
        6.3.1 金納米顆粒的制備及表征
        6.3.2 抗體的預(yù)處理
        6.3.3 金納米顆粒的修飾
        6.3.4 GNPs探針的表征
        6.3.5 直接競爭生物條形碼方法的基本步驟
        6.3.6 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化
        6.3.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
        6.3.8 樣品的預(yù)處理及分析檢測
        6.3.9 回收率
    6.4 結(jié)果與討論
        6.4.1 GNPs的修飾及表征
        6.4.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化
        6.4.3 實(shí)驗(yàn)方法的建立
        6.4.4 樣品的分析檢測
        6.4.5 回收率
    6.5 本章小結(jié)
第七章 結(jié)論與展望
    7.1 結(jié)論
    7.2 創(chuàng)新點(diǎn)
    7.3 展望
參考文獻(xiàn)
附錄 1
致謝
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【參考文獻(xiàn)】

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