硝基苯廢水成分復(fù)雜,常含有大量對(duì)微生物有抑制作用的鹽�；诖�,本論文馴化、篩選耐鹽硝基苯降解菌,對(duì)其進(jìn)行生理生化鑒定,研究其耐鹽和降解硝基苯特性。在此基礎(chǔ)上,對(duì)其降解硝基苯代謝基因進(jìn)行定位,并進(jìn)一步利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)克隆到部分基因并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。 從活性污泥中馴化分離到2株耐鹽硝基苯降解菌,通過(guò)形態(tài)觀察、生理生化分析、G+C含量分析和16S rDNA分析分別鑒定為Streptomyces sp.DUT_AHX和Micrococcussp.DUT_AHX,其16S rDNA序列的GenBank登錄序列號(hào)分別為DQ409080和DQ409081。 Streptomyces sp.DUT_AHX的最適生長(zhǎng)與降解條件為:溫度30℃,pH 7.0,轉(zhuǎn)速150r/min,菌株在唯一碳源培養(yǎng)基中可耐受的最大硝基苯濃度為900 mg/L。Micrococcus sp.DUT_AHX的最適生長(zhǎng)與降解條件為:溫度37℃,pH 7.0,轉(zhuǎn)速150 r/min,菌株在唯一碳源培養(yǎng)基中可耐受的最大硝基苯濃度為600 mg/L。2株菌在以硝基苯為唯一碳、氮和能源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)和降解硝基苯過(guò)程中均釋放出NH_4~+,但未檢測(cè)到NO_2~-。在80 h內(nèi)2株菌株對(duì)硝基苯的降解率分別為98.8%和97.6%,TOC去除率為99.2%和98.1%,表明硝基苯最終被礦化為二氧化碳和水。2株菌的粗酶主要以2-氨基酚1,6-雙加氧酶活性為主。這2株菌降解硝基苯的途徑可能都是好氧部分還原途徑。 Streptomyces sp.DUT_AHX是一株中度耐鹽細(xì)菌。在鹽脅迫下某些相容性溶質(zhì)如甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸、甜菜堿、四氫嘧啶都能更好的促進(jìn)其生長(zhǎng),其中甘氨酸的效果最明顯,四氫嘧啶的效果最差。利用SDS-PAGE和非變性梯度PAGE電泳分析了鹽脅迫或硝基苯誘導(dǎo)下Streptomyces sp.DUT_AHX蛋白質(zhì)的合成變化,其中一些蛋白質(zhì)的合成被抑制;一些蛋白質(zhì)的合成被增強(qiáng):一些起主要調(diào)節(jié)作用的鹽或硝基苯誘導(dǎo)蛋白被重新合成。將非變性梯度PAGE凝膠上的大小為141 kDa的硝基苯誘導(dǎo)蛋白條帶切膠電洗脫回收,其具有2-氨基酚1,6-雙加氧酶活性,其活性大小為5.825μmol/min/mg protein,該蛋白是Streptomyces sp.DUT_AHX降解硝基苯代謝途徑中的2-氨基酚1,6-雙加氧酶。 從Streptomyces sp.DUT_AHX提取到一大小約為17 kb的質(zhì)粒pSNB1。采用提高生長(zhǎng)溫度和SDS法相結(jié)合消除質(zhì)粒,篩選到一質(zhì)粒消除菌株AHX-4,失去了氨芐青霉素抗性和降解硝基苯的能力。將質(zhì)粒pSNB1經(jīng)CaCl_2熱激轉(zhuǎn)化法進(jìn)入大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞,篩選到一個(gè)可在以硝基苯為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽平板上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化大腸桿菌陽(yáng)性子AHX-JM109,其降解硝基苯的能力大大降低。質(zhì)粒pSNB1與Streptomyces sp.DUT_AHX的抗性基因和降解硝基苯的基因有關(guān),而與耐鹽基因無(wú)關(guān)。 以質(zhì)粒pSNB1為模板和RedF、RedR為引物的簡(jiǎn)并降落PCR擴(kuò)增到一大小為465 bp的基因片段,氨基酸序列檢索表明,其與Marine actinobacterium PHSC20C1的YHS域蛋白的同源性較高;設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行盒式連接介導(dǎo)PCR,拼接得到大小為2026 bp的序列,開(kāi)放閱讀框分析發(fā)現(xiàn)一個(gè)編碼126個(gè)氨基酸的ORF,屬于YHS域蛋白,其代表的基因可能是Streptomyces sp.DUT_AHX的硝基苯硝基還原酶基因PPH_AHX,其GenBank中登錄的序列號(hào)為EF998874。生物信息學(xué)分析表明,pPH_AHX基因編碼的蛋白理論等電點(diǎn)為4.8,理論分子量為13.49089 kDa,為一位于細(xì)胞質(zhì)的弱酸性、水溶性球狀蛋白。通過(guò)不同程序預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu),并構(gòu)建了該蛋白部分三維結(jié)構(gòu)模型。
【學(xué)位單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2008
【中圖分類(lèi)】：X172
【部分圖文】：

大連理工大學(xué)博士學(xué)位論文處理和硝基苯生物降解研究進(jìn)展世界經(jīng)濟(jì)處于高速發(fā)展階段，中國(guó)、印度、俄羅斯和的“金磚四國(guó)”，但同時(shí)環(huán)境污染問(wèn)題也日益嚴(yán)重。僅境污染事件，例如，云南滇池久治不愈的藍(lán)藻污染，污染，武漢東湖大規(guī)模死魚(yú)事件，江蘇沐陽(yáng)水源污染日益嚴(yán)重，對(duì)國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人民身體健康己構(gòu)成嚴(yán)污染并行的兩難困境，創(chuàng)造自然與社會(huì)和諧相處的新不面對(duì)、也不能不解決的終極命題。

圖1.2硝基苯污染導(dǎo)致的松花江死魚(yú)DeadfishofsonghuaRiverPOllutedby究進(jìn)展質(zhì)飛次圖1.3硝基苯的化學(xué)結(jié)構(gòu)ig.1.3Chemiealstruetureofnitrobenz狀液體，工業(yè)品常因含雜質(zhì)而顯淡

圖1.14菌株JS765的硝基苯1，2一雙加氧酶的立體結(jié)構(gòu)Fig.1.14StrUetoreofnitrobenzenel，2一dioxygenaseofstrainJS765Parale:等I”呂l純化和比較T菌株Js765的硝基苯雙加氧酶和菌加氧酶系統(tǒng)組成成份的晶體結(jié)構(gòu)。Friemann等l”9]進(jìn)一步通過(guò)蛋

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 馬溪平;王延剛;徐成斌;魏娜;;微生物降解硝基苯廢水的研究進(jìn)展[J];生態(tài)科學(xué);2011年05期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 侯振靈;預(yù)氧化—混凝—沉淀對(duì)銅綠微囊藻與SOC復(fù)合污染的去除[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2011年

2 王延剛;耐鹽硝基苯降解菌的篩選及降解特性研究[D];遼寧大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2825993