【摘要】：含硫雜環(huán)芳烴(PASHs)是原油中硫的主要存在形態(tài),具有強富集性、致癌、致畸、致突變及難以生物降解等特點,潛在威脅著生態(tài)系統(tǒng)及人體健康。本研究從含硫雜環(huán)芳烴高效降解菌的篩選與鑒定、培養(yǎng)條件優(yōu)化、代謝途徑分析,以及對其它典型污染物的降解特性等方面進行深入系統(tǒng)研究,并對降解菌產(chǎn)生的生物表面活性劑進行結(jié)構(gòu)分析和理化性質(zhì)研究,最后利用該降解菌對污染土壤進行生物強化修復研究,以期為減緩或消除該類化合物對環(huán)境的影響提供理論基礎(chǔ)和指導。本研究選擇二苯并噻吩(DBT)作為PASHs模式物,從勝利油田長期受石油污染土壤中篩選分離得到5株降解單菌,通過生理生化實驗和16S rDNA序列分析將其鑒定到屬分類階元,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,進行系統(tǒng)發(fā)育分析。選擇降解性能最好的Pseudomonas sp.LKY-5進行單因素實驗,利用響應曲面法對培養(yǎng)條件進行優(yōu)化�；趯嶒灁�(shù)據(jù)的多元回歸擬合,建立二次多項式回歸方程的預測模型,方差分析、殘差分析和實驗驗證表明該預測模型可靠有效。顯著性分析識別出底物濃度是影響降解效果的關(guān)鍵因素,當DBT濃度為100mg/L,溫度為25℃~31℃,pH值為7.2~8.5,搖床轉(zhuǎn)速為140rpm~180rpm范圍內(nèi),7d可以基本完全降解。利用GC-MS對Pseudomonas sp.LKY-5的代謝中間產(chǎn)物進行分析和鑒定,推測其可能的代謝途徑,發(fā)現(xiàn)菌株LKY-5同時具備兩條完全礦化的代謝途徑(擴展的“4S”途徑和擴展的“Kodama”途徑),具有較高的生物修復價值。以正十六烷、菲、芘和咔唑分別代表石油中其他組分(正構(gòu)烷烴、多環(huán)芳烴和含氮雜環(huán)芳烴),考察菌株LKY-5對這些底物的降解能力,結(jié)果表明在單一體系中該菌株對這些底物均有降解效果,降解能力為正十六烷菲咔唑芘。在與DBT復合的雙底物體系中,正十六烷、菲對DBT的降解呈促進作用,芘、咔唑呈抑制作用,而DBT對這些底物的降解均起抑制作用。通過對不同類型柴油的降解特性研究,發(fā)現(xiàn)Pseudomonas sp.LKY-5對其中各種硫化物均有不同程度的降解�；贒BT代謝中間產(chǎn)物中檢測到一些長鏈烷烴和有機酸,推測Pseudomonas sp.LKY-5在降解過程中產(chǎn)生了生物表面活性劑。利用薄層色譜和HPLC-ESI-MS對該表面活性劑進行分析和鑒定,結(jié)果表明該表面活性劑為雙鼠李糖脂(糖脂結(jié)構(gòu)為Rha-Rha-C_8-C_(8:1)),另外還含有少量的游離脂肪酸(C_(18)、C_(18:1)、C_(19)、C_(19:1)、C_(20:1)、C_(20))。經(jīng)過對該表面活性劑基本理化性質(zhì)(臨界膠束濃度、親水親油平衡值、乳化性能)的測定,以及穩(wěn)定性能考察,表明該表面活性劑在高溫、高pH、高鹽度等極端環(huán)境下仍具有很好的表面活性。最后將Pseudomonas sp.LKY-5應用在DBT污染土壤的生物強化修復中,考察了污染強度、初始菌量、初始含水率、氮磷比、膨松劑用量對修復效果的影響,得到了最佳修復條件,為進一步實現(xiàn)含硫雜環(huán)芳烴污染土壤原位生物修復提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。
【學位授予單位】：中國石油大學(華東)
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：X172
【圖文】：

21LKY-13圖 2-2 降解菌株的平板劃線Fig.2-2 The results of plates streaking with degrading strains

第二章 含硫雜環(huán)芳烴降解菌的篩選、鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化降解菌株的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析 細菌基因組 DNA 的提取及 PCR 擴增試劑盒提取得到的 5 株降解菌 DNA 進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到了相圖 2-3（a）中 1、2、3、4 和 5 泳道（分別表示 LKY-1、LKY-3、LKY-5、Y-13 菌株）所示，并且與分子標記 λ-EcoT14 digest DNAMarker 電泳條帶（行對比，發(fā)現(xiàn)所獲得的細菌 DNA 片段長度完全滿足下一步 PCR 的要求。泳條帶整體偏暗，含量較少，為了滿足后續(xù) 16S rDNA 測序所需要的量， PCR 擴增，擴增得到的 PCR 產(chǎn)物電泳圖如圖 2-3（b）所示。從圖 2-3（b 1、2、3、4 和 5 泳道在 Marker 1500bp 處有明顯條帶，陰性對照（-）沒有出該 PCR 反應體系能夠有效擴增出目標產(chǎn)物，并且在操作過程中沒有造成

圖 2-4 降解菌株的系統(tǒng)進化樹Fig.2-4 The phylogenetic tree of DBT degrading bacterial strains.3.4 單因素對 DBT 降解率的影響篩選分離得到的 5 株單菌（LKY-1，LKY-3，LKY-5，LKY-6，LKY-13）對二吩均具有降解效果，選擇降解效果最好的 LKY-5 菌株進行單因素實驗，考察底物度、初始 pH 值、搖床轉(zhuǎn)速和接種量對其降解率的影響。.3.4.1 底物濃度生物降解系統(tǒng)中同一種底物在其不同濃度條件下表現(xiàn)出的生物降解率是不同濃度太低不利于降解菌的存活和誘導產(chǎn)生降解酶系，濃度過高則會對微生物產(chǎn)生用，抑制底物的代謝，因此存在一個能夠被有效降解的最適底物濃度[115,116]。不同度（20mg/L~600mg/L）對LKY-5降解率的影響如圖2-5所示。當DBT濃度小于10，LKY-5 對 DBT 的降解率隨著底物濃度的升高而升高，在 DBT 濃度為 100mg/

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本文編號：2801454