【摘要】： 生物冶金工藝與其他物理化學(xué)冶金方法相比,具有成本低廉、環(huán)境友好、適于開(kāi)采貧礦、難冶礦的特點(diǎn)。提高浸礦微生物的生物活性和適應(yīng)性,將有效提高生物冶金過(guò)程的生產(chǎn)效率。 在目前已探明的金礦資源中,含砷金礦占有很大的比例,其中砷金比達(dá)到2000：1的金礦資源占總探明儲(chǔ)量的5%(劉四清宋煥斌,1998)。砷是一種具有毒性和致癌能力的半金屬物質(zhì)。在生物浸礦過(guò)程中經(jīng)常要處理砷黃鐵礦等含砷礦石。砷黃鐵礦的生物氧化過(guò)程主要由硫氧化細(xì)菌喜溫硫桿菌(Acidithiobacillus caldus)、鐵氧化細(xì)菌嗜鐵鉤端螺旋菌(Leptospirillum ferriphilum)以及鐵硫氧化菌氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)混合進(jìn)行。嗜鐵鉤端螺旋菌(Leptospirillum ferriphilum)是生物浸礦反應(yīng)中主要的鐵氧化微生物,特別是在生物氧化處理過(guò)程的中后期高氧化還原電位條件下,是處于主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)地位的鐵氧化菌。該菌主要以氧化Fe2+產(chǎn)生Fe3+獲得能量,而Fe3+則是生物浸礦過(guò)程中重要的氧化劑。嗜鐵鉤端螺旋菌的氧化活性和生命活力將直接影響含砷礦物的生物浸出效率。如果處理樣品中的砷毒離子濃度超過(guò)了嗜鐵鉤端螺旋菌的砷耐受水平,生物浸出也就難以進(jìn)行。因此,深入了解嗜鐵鉤端螺旋菌的砷耐受能力,砷抗性機(jī)制,將為進(jìn)一步的微生物育種提供理論指導(dǎo)。 但是由于嗜鐵鉤端螺旋菌的遺傳背景,生理代謝等研究甚少,無(wú)法直接從該菌現(xiàn)有的生理調(diào)節(jié)機(jī)制及遺傳基礎(chǔ)入手獲得該菌的砷抗性機(jī)制。所以,采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)的研究策略,引入雙向電泳等蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù),全局性的研究該菌的砷耐受機(jī)制是一種可行的方法。 雙向電泳技術(shù)(Two dimensional electrophoresis,2-DE)可以全局性、高通量研究微生物的蛋白質(zhì)表達(dá)差異,高分辨率,高靈敏度的展示和分離出現(xiàn)差異表達(dá)的蛋白,是分析復(fù)雜混合物和蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的關(guān)鍵技術(shù)。微生物與外界環(huán)境的相互作用和生物學(xué)響應(yīng)往往是通過(guò)多個(gè)系統(tǒng)的綜合協(xié)調(diào)來(lái)完成的,涉及多種酶系和調(diào)控系統(tǒng)的變化,這正是蛋白質(zhì)組學(xué)的著眼點(diǎn)。因此,構(gòu)建L. ferriphilum的2-DE分析技術(shù)平臺(tái),并在此基礎(chǔ)上采用蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)來(lái)研究L. ferriphilum的抗砷、耐砷機(jī)制是科學(xué)合理的選擇。 L. ferriphilum是極端嗜酸性專(zhuān)性化能自養(yǎng)革蘭氏陰性菌。其獲能途徑?jīng)Q定了該菌培養(yǎng)物中菌體密度小,各種可溶性離子雜質(zhì)濃度高。而2-DE技術(shù)則要求樣品中蛋白濃度較高,雜質(zhì)濃度,尤其是各種可溶性離子雜質(zhì)濃度盡可能的低。因此,普通的2-DE方案無(wú)法獲得分離良好,點(diǎn)量豐富的L. ferriphilum 2-DE圖譜,目前國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有關(guān)于L. ferriphilum全局蛋白2-DE實(shí)驗(yàn)的報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)2-DE的樣品制備、雜質(zhì)去除、上樣方法、聚焦參數(shù)選擇、染色方法等關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn),制定了一套適用于L. ferriphilum的2-DE實(shí)驗(yàn)方案,首次獲得了點(diǎn)陣清晰,可穩(wěn)定重現(xiàn),膠體考馬斯染色法獲得獨(dú)立蛋白點(diǎn)達(dá)到600個(gè)以上的L. ferriphilum 2-DE圖譜。 在此基礎(chǔ)上,為了開(kāi)展L.f砷脅迫條件下的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究,本研究通過(guò)馴化培養(yǎng)獲得具有較高耐砷性能的L.f菌株,通過(guò)2D電泳技術(shù)把耐砷菌株和普通對(duì)照菌株的菌體蛋白進(jìn)行比較,確定差異蛋白,通過(guò)MALDI-TOF、MS/MS技術(shù)和相關(guān)生物信息學(xué)檢索比對(duì)工具對(duì)差異蛋白進(jìn)行分析。從而更全面地了解L.f的耐砷機(jī)制。目前已知的微生物耐砷抗砷系統(tǒng)主要是廣泛存在的Arsenic Resistance System,即Ars系統(tǒng)。近期還有報(bào)道在砷脅迫條件下,某些熱激蛋白(HSP蛋白),產(chǎn)能代謝相關(guān)蛋白,質(zhì)膜陰離子通道蛋白的表達(dá)量也會(huì)提高。顯示在砷脅迫條件下,細(xì)胞試圖通過(guò)排出毒性離子、提高能源供給、提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性等途徑維持正常的生理生化活動(dòng)。通過(guò)對(duì)L. ferriphilum ML-04的耐砷菌株和普通出發(fā)菌株的蛋白質(zhì)2-DE圖譜進(jìn)行數(shù)字化比對(duì)和分析,發(fā)現(xiàn)65個(gè)蛋白點(diǎn)出現(xiàn)超過(guò)3倍的表達(dá)量變化(t-test,p0.05)。有38種蛋白得到高分匹配和識(shí)別,其中,有25種蛋白質(zhì)匹配確認(rèn)了具體的生物學(xué)功能。其中很多蛋白有助于提高細(xì)胞對(duì)砷的耐受能力,包括促進(jìn)三價(jià)砷離子的排出以保護(hù)一些重要蛋白的穩(wěn)定性；保護(hù)和促進(jìn)修復(fù)染色體,保障染色體的復(fù)制過(guò)程；避免重要的硫、磷元素的浪費(fèi)；保持一些重要的砷耐受蛋白的活性等。而且,為了更有效的保護(hù)細(xì)胞,提高砷耐受能力,L. ferriphilumML-04還通過(guò)改變代謝通路中一些關(guān)鍵酶的表達(dá)量調(diào)整了細(xì)胞內(nèi)一些代謝通路,例如碳水化合物的代謝、能量代謝、氨基酸代謝等。 此外,該蛋白質(zhì)組學(xué)研究還檢測(cè)到了2套Ars砷抗性系統(tǒng)。一套是arsRC-arsB型的LJML04Ars1基因簇,一套是arsRDABC型LfML04Ars2基因簇。與先前報(bào)道的arsRDABC基因簇相比,LfML04Ars2基因簇中還多了一個(gè)編碼框,編碼了Pst型磷酸特異性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的PstS蛋白。該P(yáng)stS蛋白所屬的Pst磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是細(xì)胞應(yīng)對(duì)磷酸饑餓及抗五價(jià)砷毒離子相關(guān)系統(tǒng)。該系統(tǒng)的組成蛋白出現(xiàn)在砷抗性系統(tǒng)中,暗示在嗜鐵鉤端螺旋菌ML-04菌株中,砷抗性系統(tǒng)與某些磷酸饑餓響應(yīng)系統(tǒng)存在聯(lián)動(dòng)關(guān)系。由于砷毒離子可以造成細(xì)胞磷酸饑餓,并可以干擾細(xì)胞內(nèi)的多種磷酸化反應(yīng)過(guò)程,這種砷抗性系統(tǒng)與磷酸饑餓響應(yīng)系統(tǒng)的聯(lián)動(dòng)可以使ML-04獲得更強(qiáng)的砷耐受能力。 本研究建立的嗜鐵鉤端螺旋菌2-DE技術(shù)平臺(tái)及相關(guān)研究策略,可應(yīng)用于嗜鐵鉤端螺旋菌對(duì)其他多種環(huán)境條件變化的細(xì)胞適應(yīng)性機(jī)制的研究,例如與生物浸礦密切相關(guān)的其他金屬毒性離子的抗性和耐受機(jī)制、能量代謝變化、pH擾動(dòng)、熱沖擊響應(yīng)等生理生化過(guò)程,對(duì)于實(shí)際細(xì)菌浸出過(guò)程的優(yōu)化,高效浸礦菌的微生物育種都具有重要的參考價(jià)值和理論意義。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：X172
【圖文】：

代硫酸鹽途徑與多硫化合物途徑比較示意圖(SehippersanSehiPPersetal.1996)離子從金屬硫化物奪電子被還原成亞鐵離子，而金屬硫化物分子則

山東大學(xué)博士學(xué)位論文子對(duì)目標(biāo)礦石顆粒發(fā)揮氧化作用。接觸作用機(jī)制指浸礦微生物吸附、貼合在硫化物表面，并發(fā)揮氧化溶出作用(圖2.)。微生物主要靠靜電力吸附在硫化物表面。例如氧化亞鐵硫桿菌的細(xì)胞外基質(zhì) (extracellularpolymericsubstanees，EpS)含有一定濃度的三價(jià)鐵離子，每個(gè)三價(jià)鐵離子都與兩個(gè)糖醛酸殘基結(jié)合。這樣就使氧化亞鐵硫桿菌的EPS帶有了正電荷，而黃鐵礦等硫化礦表面在環(huán)境pH低于2時(shí)是帶有負(fù)電荷的，這樣細(xì)胞就通過(guò)靜電力作用吸附在了硫化礦表面(圖2.B) (Blakeetal1994:Grutzner200x;Solarietal.1992)。因此在接觸作用機(jī)制中，三價(jià)鐵離子的首要作用是介導(dǎo)了浸礦菌細(xì)胞對(duì)目標(biāo)礦物的吸附過(guò)程。三價(jià)鐵離子的第二個(gè)作用才是把目標(biāo)礦物氧化溶出。在接觸反應(yīng)機(jī)制中電化學(xué)反應(yīng)是在浸礦微生物的細(xì)胞壁和硫化礦物表面之間的空間發(fā)生的。由上述可知，在接觸反應(yīng)機(jī)制和非接觸反應(yīng)機(jī)制中，微生物都是通過(guò)產(chǎn)生三價(jià)鐵離子和進(jìn)一步的對(duì)礦物溶出的硫化物進(jìn)行氧化來(lái)實(shí)?

石中的地質(zhì)學(xué)循環(huán)示意圖

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 蘇玉斌;金龜子綠僵菌致病力與發(fā)育的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];福建農(nóng)林大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2798125