【摘要】：藍藻是地球上分布最廣泛、最原始的放氧光合作用原核生物,在適宜水體中會大量生長繁殖,形成藍藻水華。藍藻的光合作用是從藻膽蛋白組成的藻膽體結構吸收光能開始的。藻膽蛋白是一個多亞基組成的蛋白復合物,每個亞基上結合不同的開環(huán)四吡咯色素分子(色基),使得它們可以吸收不同波長的光能。藍藻體內,藻膽色素與脫輔基藻膽蛋白的正確連接一般都需要特異的裂合酶來催化完成。目前已發(fā)現(xiàn)裂合酶CpcE/F催化脫輔基蛋白CpcA與藻藍色素PCB的連接,裂合酶PecE/F催化PCB異構為PVB并與脫輔基蛋白PecA連接,裂合酶CpeS1不僅催化PCB與CpcB和PecB的Cys-84位連接,同時也能催化PCB與脫輔基蛋白ApcA、ApcB、ApcA2、ApcD、ApcF的連接。裂合酶CpeTl能催化CpcB和PecB的β亞基Cys-155位與藻藍色素PCB的偶聯(lián)。 本文以原核生物藍藻PCC 7421藻紅蛋白(CPE)為研究對象,首先研究了CPE的生物合成。本文以已知的有活性的裂合酶進行同源搜索,找出了20個可能的裂合酶。利用共表達載體,將CPE脫輔基亞基CpeA或CpeB、合成色基的血紅素氧化酶HO1、氧化還原酶PebA、PebB及可能的裂合酶在大腸桿菌中共同表達。在裂合酶CpeY的催化作用下,大腸桿菌能夠利用自身的亞鐵血紅素合成具有與天然CPEα亞基一致的特征吸收和熒光光譜的重組色素蛋白holo-CpeA。裂合酶CpeS2對CpeB和PEB的共價結合有一定的催化活性。 Zhao等發(fā)現(xiàn)來自魚腥藻PCC7120的裂合酶CpeSl能催化絲狀藍藻PCC7601中藻紅蛋白α亞基Cys-82位和β亞基Cys-80位與藻紅膽素PEB的偶聯(lián)。無類囊體藍藻PCC7421和絲狀藍藻PCC7601中的CPE有極高的同源性,我們將脫輔基蛋白替換為PCC7601中的CpeA(C82A)、CpeB(C80S/C165S)和CpeB(C48A/C59S/C80S)進行體內重組,但是未能找到有催化活性的酶或酶的組合。 植物光敏色素是一種重要的光受體,藍細菌光敏色素是發(fā)現(xiàn)于藍藻內的一種藻膽色素蛋白,其蛋白質結構與植物光敏色素有較高的同源性,生理功能上與植物光敏色素也有很大的相似性,在藍藻內起著光信號受體的作用。藍細菌光敏色素分子結構相對簡單、易于進行分子設計,是研究光敏色素分子功能、生理機制的優(yōu)良模型。 本文以來自Anabaena sp. PCC 7120的aphC基因及其編碼蛋白AphC為對象,對藍細菌光敏色素AphC及其GAF結構域的體內重組和體外重組及其作用機制進行了研究。 首先采用聚合酶鏈式反應方法從魚腥藻Anabaena sp. PCC 7120,總DNA中克隆出完整的aphC,同時通過同源性分析,構建了以下aphC的4個定點突變體對其功能區(qū)域及功能氨基酸殘基進行了分析,即：aphC(C138L), aphA(C478A), aphA(C554L)和aphA(C138L/C554L)。將這些基因片段構建入表達載體pET-30a(+)中,含目的基因的表達載體、血紅素氧化酶HO1和膽綠素還原酶PcyA同時轉入大腸桿菌體內共表達。根據重組產物的光譜特征峰分析,發(fā)現(xiàn)色素蛋白PCB-AphC顯示出兩種獨立的可逆光致變色效應。AphC中具有兩個獨立的可結合色素的GAF結構域,分別是GAF1結構域和GAF3結構域。將單獨的GAF1和GAF3分別與PCB重組得到的產物也可以分別顯示出一種與PCB-AphC一致的可逆光致變色效應。實驗證明PCB-GAF1在700nnm和570nm光照條件下分別表現(xiàn)為紅光吸收(λmax=636nm, Pr)和遠紅外光吸收(λmax= 684nm, Pfr), PCB-GAF3在700nm和610nm光照條件下分別表現(xiàn)為紅光吸收(λmax= 644nm, Pr)和橙光吸收(λmax=584nm, Po)。色素蛋白經酸性尿素變性后,紫外吸收峰值在662nm左右,表明所連接的色素為藻藍色素PCB。色素蛋白的蛋白質電泳經醋酸鋅染色后,在紫外光照射下發(fā)出鋅熒光,證明色素與蛋白的連接方式為共價偶聯(lián)。利用光譜數(shù)據可計算得到色素蛋白的熒光量子產率、摩爾消光系數(shù)等。 PCB-GAF3的橙光吸收(Po)在黑暗條件下會快速的自發(fā)轉化為紅光吸收(Pr),PCB-GAF1的遠紅外光吸收(Pfr)在黑暗條件下會緩慢的轉化為紅光吸收(Pr)。在-77K低溫狀態(tài)下,可以測得PCB-GAF3的橙光吸收型完整的熒光光譜。色素蛋白PCB-AphC、PCB-AphC(C138L)和PCB-AphC(C554L)經純化后測圓二色譜,在紫外光區(qū)的圓二色譜顯示出α-螺旋結構。AphC在C端有組氨酸激酶結構域,實驗證明色素蛋白PCB-AphC的自磷酸化與其可逆光致變色相關,在紅光吸收(Pr)下發(fā)生的自磷酸化程度較弱。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：X173

【引證文獻】

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1 王娟;光敏色素蛋白的克隆表達和藻紅藍蛋白α亞基的特性分析[D];湖北師范學院;2013年

2 劉冰冰;藍細菌光敏色素結構域體內重組及光化學性質研究[D];華中農業(yè)大學;2013年

本文編號：2793709