【摘要】：隨著我國城鎮(zhèn)化和工業(yè)化進程的發(fā)展,生活污水和工業(yè)廢水排放量增加,“十三五”規(guī)劃在提高污水排放標準的同時,提出了控制總氮排放量的新要求,為此高效生物脫氮技術的研究與開發(fā)再度成為研究熱點。目前已建的污水處理廠急需升級改造,強化提升硝酸鹽氮的去除是生物脫氮技術的難點。本研究基于好氧反硝化菌能夠?qū)⑾鯌B(tài)氮或亞硝態(tài)氮在同一反應器中完成硝化反硝化,易于與現(xiàn)有好氧工藝進行銜接改造的潛在優(yōu)勢,利用好氧反硝化菌具有生長速度快、適用氮濃度范圍寬、水質(zhì)環(huán)境適應性強的特點,針對當前缺乏高效好氧反硝化菌株資源以及生物強化系統(tǒng)中的菌群競爭問題,從長期運行的廢水處理系統(tǒng)中分離獲得一株高效好氧反硝化菌,基于菌株多相分類鑒定和反硝化動力學分析;構建了好氧反硝化菌與固定化載體相結(jié)合的生物強化工藝,分別應用于低氮素的生活污水和高氮工業(yè)廢水的脫氮研究;借助高通量測序技術和微生物網(wǎng)絡分析方法探討了目標菌株的演替變化,分析了生物強化工藝中主要反硝化功能菌的多樣性和功能作用,為好氧反硝化技術理論向?qū)嶋H轉(zhuǎn)化提供實驗依據(jù)和技術指導。通過連續(xù)曝氣和間歇曝氣相結(jié)合的方式定向馴化、篩選獲得一株高效好氧反硝化菌Pseudomonas sp.T13,采用響應面法優(yōu)化好氧反硝化過程中的關鍵影響因子(溫度、pH、碳氮比和溶解氧),當溫度為30℃、pH 7.0、C/N為7:1、溶解氧為2.5 mg/L時,T13的硝酸鹽去除率可達到90%以上。對Pseudomonas T13進行全基因組測序,表明好氧反硝化菌T13具有高效硝酸還原功能基因,硝酸鹽還原酶的檢測發(fā)現(xiàn)硝酸鹽還原酶比例占脫氮酶基因的30%以上。利用Logistic方程和雙Monod模型構建了菌株T13的生長動力學模型和反硝化動力學模型,描述了菌株T13的微生物生長動力學過程及底物與反硝化作用關系,充分揭示好氧環(huán)境下反硝化菌的動力學規(guī)律,為菌株T13強化好氧反硝化系統(tǒng)構建提供重要的理論支持。采用活性炭-聚氨酯載體構建了Pseudomonas sp.T13生物強化流化床反應器,以預掛膜的方式啟動反應器處理低氮素的生活污水,對反應器運行條件進行優(yōu)化,分析了生活污水的功能菌群對T13的競爭影響。T13預掛膜反應器對生活污水中總氮去除率達到89±4%,較未經(jīng)過預掛膜的生物強化反應器高8%,其中硝酸鹽去除率在預掛膜強化反應器中達到93±7%,未預掛膜系統(tǒng)為88±7%,生活污水中氨氮含量較低,在好氧反硝化條件下氨氮去除率分別達到93±1%和97±1%,出水的亞硝酸鹽分別達到1.1 mg/L和0.7 mg/L,出現(xiàn)亞硝酸鹽積累。對持續(xù)兩個月工藝運行的群落監(jiān)測,分析了生物載體所附著T13與生活污水中其他菌群的演化過程。分析發(fā)現(xiàn),系統(tǒng)中Brucella和Brevundimonas的同時富集,導致后期一個相對較低的總氮去除率,且發(fā)生亞硝酸鹽殘留,分析認為Brevundimonas與Pseudomonas stutzeri的代謝過程類似,在高溶解氧條件下會形成亞硝酸鹽的積累,因此在COD不足時更容易造成總氮去除率降低。針對含有高濃度的硝酸鹽和亞硝酸鹽的煤制乙二醇工業(yè)廢水難以實現(xiàn)有效生物脫氮處理的問題,采用T13構建的好氧反硝化工藝研究了不同進水負荷對強化菌株的沖擊和影響,采用生物網(wǎng)絡分析的方法對目標菌株與其他脫氮菌群關系進行了揭示。通過煤制乙二醇廢水的生物毒性試驗分析表明,在活性炭-聚氨酯載體中附著的生物菌群比懸浮菌群具有更良好的抗高濃度沖擊能力。在進水濃度為實際廢水50%以下的濃度條件時,硝酸鹽去除率可以達到50%,COD去除率達到65%以上,進一步增加進水負荷導致總氮(TN)去除率降低20-30%,主要是降低了硝酸鹽和亞硝酸鹽的去除率�；趎apA基因的脫氮過程分析表明當載體生物膜中Pseudomonas sp.T13的比例低于10%時,硝酸鹽和亞硝酸鹽去除率明顯降低,隨著高硝氮煤化工廢水處理時間的持續(xù)延長,假單胞菌降低的同時伴隨著其它脫氮菌Paracoccus、Brevundimonas和Brucella等的生長和富集。研究表明生物載體能夠提升好氧反硝化過程的總氮去除效率,在載體內(nèi)部形成溶解氧的梯度濃度變化,為反硝化過程提供一個有效的好氧至厭氧的反應區(qū)域,在載體外層具備較充分的氧氣,促進好氧反硝化菌的生長及硝酸鹽的還原,并在內(nèi)部低氧或厭氧條件下實現(xiàn)好氧反硝化過程中的亞硝酸鹽還原。采用載體預掛膜附著T13的方法有效強化了工藝的總氮去除效果,而采用目標菌株與污水混合的強化方式會因其它功能菌群的競爭導致目標菌的快速衰減,從而無法形成特定的目標菌,影響TN去除效果。因此,在未來的群落功能組建中考慮載體傳質(zhì)過程對硝酸鹽的去除影響可指導生物反應器的調(diào)節(jié)和優(yōu)化。
【學位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：X703
【圖文】：

napA 16S圖2-3 PCR凝膠電泳圖Figure 2-3 PCR gel electrophoresis實時熒光定量PCR儀（ABI 7500 FAST，美表2-18 PCR反應混合液Table 2-18 Mixture of PCR reaction試劑（濃度） 用量μLDNA模板 0.5dNTP (10 mmol/L) 0.5Taq Buffer (10×) 2.5MgCl2(25 mmol/L) 2Taq Polymerase 0.2PCR-grade pure H2O 18.3Primer F (10 μmol/L) 0.5Primer R (10 μmol/L) 0.5

第 2 章 實驗材料與方法DOTUR和Phylip等軟件計算矩陣距離并由此進行聚類分析，根據(jù)97%相似性劃分分類操作單元 (operational taxonomic units，OTU)，獲得rarefaction 曲線，計算評估豐度評價指數(shù)（Chao1）和多樣性指數(shù)（Shannon）[129]；再利用RDP na veBayesian rRNA classifier和Greengenes classify在線分類，結(jié)合BLAST比對確定所測的序列分類地位。所獲得高通量測序原始數(shù)據(jù)上傳并公開于NCBI網(wǎng)絡公開數(shù)據(jù)庫（Short Read Archive (SRA) database），獲取數(shù)據(jù)查閱登錄號PRJNA310145。2.2.6.4 菌群網(wǎng)絡構建及分析（Cytoscape network）基于Illumina 高通量測序獲得的OTUs數(shù)據(jù)，采用Cytoscape 3.2.1進行網(wǎng)絡構建[121]。相關操作如圖2-5所示。

0201 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22菌株編號00.2去圖 3-3 分離獲得 22株脫氮菌對總氮和硝氮去除能力比較Figure 3-3 Comparision of TN and NO3- N removal by 22 strains3.2.3 好氧反硝化菌多相分類鑒定3.2.3.1 好氧反硝化菌的形態(tài)特征通過平板劃線法選取單菌落，得到形態(tài)特征相同、均勻分布的細菌單克隆培養(yǎng)物，并進行革蘭氏染色，如圖 3-4。根據(jù)《伯杰氏細菌手冊》首先觀察微生物群體形態(tài)。在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 24 h 后，觀察發(fā)現(xiàn)菌株 T13的單菌落為圓形、不透明的淡黃色，直徑大小在 1.5-3.5 mm 之間，菌落邊緣不太規(guī)則，表面為凸起的褶皺，菌間具有一定粘性，具體菌落形態(tài)結(jié)果見表 3-1。對菌株進行革蘭氏染色顯示為紅色，則該菌為革蘭氏陰性菌。

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本文編號：2791240