【摘要】：久效磷農(nóng)藥是聯(lián)合國(guó)環(huán)境規(guī)劃署優(yōu)先控制污染物之一，已有研究證實(shí)久效磷農(nóng)藥對(duì)金魚、斑馬魚等硬骨魚具有雌激素效應(yīng)，而擾亂魚體內(nèi)性激素含量是其發(fā)揮雌激素效應(yīng)的關(guān)鍵。魚類性激素的合成既受到其性激素生成途徑中相關(guān)蛋白和酶類的影響也受到下丘腦-垂體-性腺軸中上游神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控。為了避免體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中來(lái)自內(nèi)分泌軸線各個(gè)器官之間的作用，本文以虹鱒魚性腺細(xì)胞系(RTG-2cells)為實(shí)驗(yàn)材料，研究久效磷農(nóng)藥暴露條件下細(xì)胞培養(yǎng)基中性激素的濃度和性激素生成相關(guān)蛋白和關(guān)鍵酶的表達(dá)水平，以說(shuō)明久效磷農(nóng)藥是否能通過(guò)性激素生成途徑影響性激素的合成；同時(shí)，從蛋白激酶A(PKA)/蛋白激酶C (PKC)兩條信號(hào)途徑在久效磷農(nóng)藥調(diào)控性激素生成相關(guān)基因表達(dá)中的作用以及久效磷農(nóng)藥暴露下胞內(nèi)cAMP含量和PKA活性的變化兩方面，研究久效磷農(nóng)藥對(duì)性激素生成相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控，從激素水平、基因表達(dá)和信號(hào)途徑三個(gè)層次，探討久效磷農(nóng)藥干擾性激素水平影響性激素生成途徑的作用機(jī)制。 本文研究結(jié)果表明： (1)久效磷農(nóng)藥對(duì)RTG-2細(xì)胞的48h IC50為243.80μg/L，當(dāng)濃度小于160μg/L時(shí)，細(xì)胞的成活率不受久效磷農(nóng)藥的影響，通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶三種酶活性的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，所選擇的久效磷農(nóng)藥暴露濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒有影響。 (2)0.1、1.0、10.0、100.0μg/L久效磷農(nóng)藥暴露細(xì)胞48h，采用放射免疫分析法檢測(cè)了培養(yǎng)基中性激素的含量，結(jié)果表明，對(duì)照組和0.1μg/L久效磷農(nóng)藥暴露組細(xì)胞培養(yǎng)基中雌激素(17β-estradiol, E2)含量低于培養(yǎng)基中雌激素的初始含量，而1.0和10.0μg/L久效磷農(nóng)藥暴露組細(xì)胞培養(yǎng)基中E2含量顯著高于初始濃度和對(duì)照組濃度；久效磷農(nóng)藥各處理組培養(yǎng)基中睪酮濃度均低于培養(yǎng)基中睪酮的初始濃度，表明久效磷農(nóng)藥能夠干擾RTG-2細(xì)胞的性激素合成，促進(jìn)了RTG-2細(xì)胞合成分泌E2。 (3)0.1、1.0、10.0、100.0μg/L久效磷農(nóng)藥暴露細(xì)胞48h，采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR (real-time PCR)的方法檢測(cè)性激素生成相關(guān)的蛋白和關(guān)鍵酶的表達(dá)水平。結(jié)果表明，各濃度久效磷農(nóng)藥對(duì)性激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(steroidogenic acuteregulatory protein, StAR)的表達(dá)水平無(wú)影響，1.0和10.0μg/L久效磷農(nóng)藥使膽固醇側(cè)鏈裂解酶(cholesterol side chain cleavage enzyme, CYP11A1)和17α羥化酶(cytochrome P45017alpha-hydroxylase, CYP17)的表達(dá)增加，0.1、1.0和10.0μg/L久效磷農(nóng)藥促進(jìn)了性腺芳香化酶P450(cytochrome P450aromatase, CYP19A)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，說(shuō)明久效磷農(nóng)藥可以通過(guò)提高性激素生成相關(guān)基因的表達(dá)水平來(lái)影響性激素的合成。 (4)基于前一部分研究，選擇影響基因表達(dá)的10.0μg/L做為久效磷農(nóng)藥暴露濃度，同時(shí)設(shè)置PKA抑制劑和PKC抑制劑與久效磷農(nóng)藥聯(lián)合暴露，暴露48h后，利用real-time PCR的方法檢測(cè)StAR、CYP11A1、CYP17和CYP19A的表達(dá)。結(jié)果表明PKA抑制劑與久效磷農(nóng)藥聯(lián)合暴露組，CYP11A1、CYP17和CYP19A的表達(dá)顯著低于10.0μg/L久效磷農(nóng)藥暴露組，而PKC抑制劑對(duì)各基因的表達(dá)無(wú)影響，說(shuō)明久效磷農(nóng)藥對(duì)各基因的表達(dá)調(diào)控是通過(guò)PKA途徑進(jìn)行的。 (5)0.1、1.0、10.0、100.0μg/L久效磷農(nóng)藥暴露細(xì)胞，分別在暴露0.5h、2h、4h、8h、24h和48h取樣，用酶聯(lián)免疫分析的方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度隨暴露時(shí)間和暴露濃度的變化，結(jié)果表明除1.0μg/L，其它濃度久效磷農(nóng)藥在暴露后4h內(nèi)均使cAMP濃度上升；用非放射性檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)久效磷農(nóng)藥暴露4h后PKA活性的變化，發(fā)現(xiàn)1.0、10.0和100.0μg/L久效磷農(nóng)藥使細(xì)胞內(nèi)PKA活性增強(qiáng)，證明久效磷農(nóng)藥對(duì)cAMP/PKA途徑具有促進(jìn)作用。 綜上所述，本文從性激素含量、調(diào)控性激素合成的關(guān)鍵酶基因表達(dá)水平和調(diào)控基因表達(dá)的信號(hào)途徑三個(gè)層次，研究了久效磷農(nóng)藥對(duì)性激素生成途徑的干擾作用與機(jī)制，結(jié)果表明久效磷農(nóng)藥通過(guò)對(duì)cAMP/PKA信號(hào)途徑的促進(jìn)作用，提高了性激素生成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)水平，最終使性激素的合成分泌增加。本文首次提出久效磷農(nóng)藥調(diào)控性激素生成相關(guān)基因是通過(guò)活化cAMP/PKA這一信號(hào)途徑介導(dǎo)的，并通過(guò)對(duì)性激素生成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)水平的影響來(lái)調(diào)控性激素的合成，這為與久效磷農(nóng)藥同類型不能與雌激素受體結(jié)合的雌激素效應(yīng)化合物的作用機(jī)制研究提供了參考，也為久效磷農(nóng)藥發(fā)揮的多種毒性效應(yīng)和其他內(nèi)分泌擾亂作用提供了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：X592;X174

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Effects of 3,4-DichIOrOaniline on Testicle Enzymes as Biological Markers in Rats[J];Biomedical and Environmental Sciences;2009年01期

本文編號(hào)：2775236