【摘要】：有機(jī)磷農(nóng)藥是一類高效廣譜的殺蟲劑,在全世界范圍內(nèi)大量生產(chǎn)并廣泛使用,為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)作出了卓越的貢獻(xiàn),但也帶來了嚴(yán)重的環(huán)境污染問題,其污染環(huán)境的修復(fù)引起了廣泛的關(guān)注。物理修復(fù)法和化學(xué)修復(fù)法存在成本高和產(chǎn)生二次污染等缺點(diǎn),具有一定的使用局限性；微生物修復(fù)法由于微生物種類多、分布廣、繁殖快、易變異、具有很強(qiáng)的適應(yīng)能力、對各類合成殺蟲劑能較快產(chǎn)生降解酶系、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)而被認(rèn)為是最具潛力的修復(fù)方法。 本實(shí)驗(yàn)室研究微生物對有機(jī)磷農(nóng)藥的降解已有20多年的歷史,分離得到許多高效有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌株：Pseudomonas sp. DLL-1, Sphingomonas sp. Dsp-2, Ochrobacter sp. DDV-1和.Paracoccus sp. M-1等,但由于有機(jī)磷農(nóng)藥的多樣性與復(fù)雜性,依然有一些有機(jī)磷農(nóng)藥還不能被降解。本研究的意義在于針對原先不能降解的有機(jī)磷農(nóng)藥如水胺硫磷、樂果等,分離、篩選高效降解菌株,并對菌株在各種環(huán)境條件下降解有機(jī)磷農(nóng)藥的特性進(jìn)行研究,同時(shí)克隆有機(jī)磷農(nóng)藥的水解酶基因,構(gòu)建降解能力更強(qiáng)和更廣譜的有機(jī)磷農(nóng)藥降解工程菌,為有機(jī)磷農(nóng)藥環(huán)境污染的修復(fù)工作提供科學(xué)依據(jù)和良好的生物材料。 本文采用添加水胺硫磷富集培養(yǎng)的方法,從水胺硫磷污染的土壤中分離到一株水胺硫磷高效降解菌株scl-2,結(jié)合生理生化特性和系統(tǒng)發(fā)育分析,將菌株scl-2歸類為節(jié)桿菌屬(Arthrobacter sp.),該菌株不僅能高效降解水胺硫磷,同時(shí)能降解甲基異柳磷、噠嗪硫磷、丙溴磷等多種有機(jī)磷農(nóng)藥,為有機(jī)磷農(nóng)藥的生物降解提供了新的菌種資源。Arthrobacter sp. scl-2降解水胺硫磷的最適溫度為35℃,最適pH為7.5,不受外加營養(yǎng)元素的影響,400 mg·kg-1的水胺硫磷對降解有很強(qiáng)的抑制作用,低濃度的水胺硫磷(5 mg·kg-1)對菌株的降解特性沒有影響。Arthrobacter sp. scl-2在降解水胺硫磷時(shí),液相檢測到了3個(gè)代謝產(chǎn)物,結(jié)合質(zhì)譜分析,分別鑒定為水楊酸異丙酯、水楊酸和龍膽酸,再通過測定龍膽酸開環(huán)酶系各酶的活力,推測出菌株代謝水胺硫磷的完整途徑。從Arthrobacter sp. scl-2中克隆到有機(jī)磷農(nóng)藥水解酶基因oph,對oph編碼的水解酶OPD進(jìn)行了高效表達(dá)與純化,對酶的特性進(jìn)行了詳細(xì)的研究,OPD酶降解有機(jī)磷農(nóng)藥的最適溫度為35℃,最適pH為8,Ca2+、Li+等金屬離子對酶的活性沒有影響,該酶擁有很寬的底物范圍,可降解目前國內(nèi)市場上使用的多數(shù)有機(jī)磷農(nóng)藥。降解菌scl-2制成的菌制劑進(jìn)行了南豐蜜桔水胺硫磷污染修復(fù)研究,水胺硫磷降解效率達(dá)到75%,表明降解菌株scl-2有著很強(qiáng)的應(yīng)用前景。 采用富集培養(yǎng)的方法從樂果生產(chǎn)廠家的污水處理池的活性污泥中分離到一株樂果高效降解菌Paracoccus sp. lgjj-3,據(jù)我們所知,Paracoccus sp. lgjj-3是目前報(bào)道的降解樂果效率較高的菌株之一。Paracoccus sp. lgjj-3降解樂果的最適溫度為30℃,最適pH為7.0,不受外加營養(yǎng)元素的影響,800 mg-kg-1的樂果對降解雖然有一定的抑制作用但依然能夠被降解,低濃度的樂果(5 mg-kg-1)對菌株的降解特性沒有影響。通過MS/MS和GC-MS聯(lián)合檢測,研究了Paracoccus sp. lgjj-3降解樂果的代謝途徑,鑒定出7個(gè)代謝產(chǎn)物,首次推測了一條樂果在微生物作用下的降解途徑。 為構(gòu)建具有降解底物范圍廣和不帶入外源抗性基因的生態(tài)安全型的基因工程菌株,本研究改造pUT mini-Tn5 Kml構(gòu)建出染色體無標(biāo)記隨機(jī)整合pUTTns系列載體(pUTTnsKm, pUTTnsTet和pUTTnsCm)。該系列載體利用sacB基因作為反向篩選標(biāo)記,利用同向重復(fù)序列發(fā)生重組去除外源抗生素抗性基因,載體具有改造的多克隆位點(diǎn)方便外源基因的插入,在載體抗性基因的兩端有MluI酶切位點(diǎn)可針對不同菌株進(jìn)行抗生素抗性基因置換。 利用模式菌株和野生型菌株進(jìn)行基因整合試驗(yàn)驗(yàn)證了載體的功能,表明該載體能夠多次將外源基因插入到革蘭氏陰性細(xì)菌染色體上且不帶入外源抗性基因。獲得的工程菌株的生長特性與野生菌株沒有差異,降解性能良好。本文利用該隨機(jī)整合載體將本實(shí)驗(yàn)室克隆到的兩個(gè)不具有同源性的有機(jī)磷農(nóng)藥水解酶基因mpd和oph先后插入到了樂果降解菌Paracoccus sp. L3的染色體上,構(gòu)建了廣譜且不帶外源抗性基因的有機(jī)磷農(nóng)藥降解工程菌株P(guān)aracoccus sp. L3-mpd-oph,降解譜測定表明該工程菌株能夠高效降解17種有機(jī)磷農(nóng)藥：水胺硫磷、甲基異柳磷、甲基對硫磷、敵敵畏、樂果、氧樂果等,該遺傳穩(wěn)定的工程菌株具有極強(qiáng)的應(yīng)用前景。
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：X172
【圖文】：

圖1一2HPLC檢測菌株scl一2降解水胺硫磷Fig.l一2BiodegradationofisoearboPhosbystrainsel一2(testedbyHPLC)2.2菌株Sd一2的菌體形態(tài)及生理生化特征

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本文編號(hào)：2773392